中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)
ny/t 4310-2023
飼料中吡啶甲酸鉻的測(cè)定高效液相色譜法
determination of chromium picolinate in feeds-
high performance liquid chromatography
前言
本文件按照gb/t 1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。
請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。
本文件由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)局提出。
本文件由全國(guó)飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（sac/tc 76）歸口。
本文件起草單位：浙江省獸藥飼料監(jiān)察所。
本文件主要起草人：任玉琴、吳望君、羅成江、侯軒、王彬、裘丞軍、陳曉林、黃娟。
1范圍
本文件描述了飼料中吡啶甲酸鉻的高效液相色譜測(cè)定方法。
本文件適用于配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料和添加劑預(yù)混合飼料中吡啶甲酸鉻的測(cè)定。
本文件配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料的檢出限為0.05mg/kg定量限為0.1mg/kg.添加劑預(yù)混合飼料的檢出限為0.1 mg/kg、定量限為0.5 mg/kg。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
gb/t 6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法
gb/t 20195動(dòng)物飼料試樣的制備
3術(shù)語(yǔ)和定義
本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義
4原理
試樣中的吡啶甲酸鉻用乙腈提取，經(jīng)濃縮凈化后，用高效液相色譜儀測(cè)定，外標(biāo)法定量。
5試劑或材料
除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?br>5.1水：gb/t 6682，一級(jí)。
5.2乙腈：色譜純。
5.3甲醇。
5.4 10%乙腈溶液：量取10ml乙腈；加水至100 ml混勻。
5.5乙腈溶液飽和的正己烷：量取正已燒900/ml，加10%乙腈溶液（5.450ml混勻，靜置，取上層溶液。
5.6磷酸鹽緩沖液（ph7.0）：稱取三水合磷酸氫二鉀5.7g、無(wú)水磷酸二氫鉀3.4g，加水溶解并定容至1 000 ml，混勻。
5.7標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（250μg/ml）：稱取吡啶甲酸鉻標(biāo)準(zhǔn)品（cas號(hào)：14639-25-9，純度≥98.0%）25 mg（精確至0.01 mg），置于100 ml容量瓶中，加乙腈（5.2）超聲溶解，用乙腈定容，混勻。2℃~8℃保存，有效期6個(gè)月。
5.8標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（25μg/ml）：準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（5.7）10 ml于100 ml容量瓶中，用水定容，搖勻。臨用現(xiàn)配。
5.9標(biāo)準(zhǔn)系列溶液；準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（5.8）適量，用水定容，配制成濃度分別為0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/m、2.0μg/ml、5.0μg/ml標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。臨用現(xiàn)配。
5. 10固相萃取柱：混合型陰離子交換柱，500 mg/6ml。
5.11微孔濾膜：0.45μm，有機(jī)系。
6儀器設(shè)備
6.1高效液相色譜儀：配紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器。
6.2分析天平：精度0.01 mg、0.1 mg和1 mg。
6.3離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于8 000 r/min。
6.4氮吹儀。
6.5超聲波清洗器。
6.6渦旋混合器。
7樣品
按（gb/t 20195制備樣品，粉碎使其全部通過(guò)0.45mm孔徑的分析篩，充分混勻，裝入磨口瓶中，備用。
8試驗(yàn)步驟
8.1提取
平行做2份試驗(yàn)。稱取配合飼料約5 g、濃縮飼料和精料補(bǔ)充料3 g~5 g、添加劑預(yù)混合飼料約1 g，精確至0.1mg，置于50ml離心管中，加入乙腈（5.2）25ml，渦旋或超聲（超聲溫度不超過(guò)50℃）20 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液，置于容量瓶中。殘?jiān)靡译妫?.2）25 ml重復(fù)提取1次，合并2次提取液，用乙腈（5.2）定容至50 ml，混勻。
8.2濃縮、凈化
8.2.1配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料
準(zhǔn)確移取提取液（8.1）5 ml~50 ml（v1，相當(dāng)于吡啶甲酸鉻0.5μg~50μg），于50℃下用氮?dú)獯抵两?，?.00 ml 10%乙腈溶液（5.4），超聲或渦旋使溶解，加乙腈溶液飽和的正己烷（5.5）3 ml除脂，渦旋10 s，8 000 r/min離心3 min，取下層清液1.00 ml（v2），加3 ml水，混勻，為試樣溶液a。取固相萃取柱（5.10）依次用5 ml甲醇（5.3）和5 ml水預(yù)淋洗，取試樣溶液a全部過(guò)柱，用8 ml乙腈（5.2）洗脫，收集洗脫液，于50℃下用氮?dú)獯抵两桑?.00ml（v3）10%乙腈溶液（5.4）超聲或渦旋使溶解，用0.45μm微孔濾膜（5.11）過(guò)濾，濾液為試樣溶液。
8. 2.2添加劑預(yù)混合飼料
準(zhǔn)確移取提取液（8.1）5ml~50ml（v1，相當(dāng)于含吡啶甲酸鉻0.25μg~25μg），置于離心管中，于50℃下用氮?dú)獯抵两桑瑴?zhǔn)確加入5ml 10%乙腈溶液（5.4），超聲或渦旋使溶解，8000r/min離心5 min，取上清液用0.45μm微孔濾膜（5.11）過(guò)濾，濾液為試樣溶液。
8.3液相色譜參考條件
色譜柱：c18柱，長(zhǎng)250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5μm，或性能相當(dāng)者；
柱溫：30℃；
檢測(cè)波長(zhǎng)：264 nm；
流速：0.8 ml/min；
進(jìn)樣量：50μl；
流動(dòng)相：a為乙腈（5.2）；b為磷酸鹽緩沖液（5.6），梯度洗脫程序見(jiàn)表1。
8.4測(cè)定
8.4.1標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和試樣溶液測(cè)定
在儀器的最佳條件下，分別取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（5.9）和試樣溶液（8.2.1或8.2.2）上機(jī)測(cè)定。吡啶甲酸鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖見(jiàn)附錄a。
8.4.2定性
以保留時(shí)間定性，試樣溶液中吡啶甲酸鉻色譜峰的保留時(shí)間應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（濃度相當(dāng)）中吡啶甲酸鉻色譜峰的保留時(shí)間一致，其相對(duì)偏差應(yīng)在±2.5%。
8.4.3定量
以吡啶甲酸鉻的濃度為橫坐標(biāo).色譜峰面積（響應(yīng)值）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.99。試樣溶液中吡啶甲酸鉻的濃度應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。如超出范圍，應(yīng)將試樣溶液用10%乙腈溶液（5.4）稀釋后，重新測(cè)定。單點(diǎn)校準(zhǔn)定量時(shí)，試樣溶液中吡啶甲酸鉻的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液中吡啶甲酸鉻的峰面積相差不超過(guò)30%。
9試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理
配合飼料、濃飼縮飼料、精料補(bǔ)充料試樣中吡啶甲酸鉻的含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω計(jì)，數(shù)值以毫克每千克（mg/kg）表示。多點(diǎn)校準(zhǔn)按公式（1）計(jì)算，單點(diǎn)校準(zhǔn)按公式（2）計(jì)算。
式中：
ρ——從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的試樣溶液中吡啶甲酸鉻質(zhì)量濃度的數(shù)值，單位為微克每毫升（μg/ml）；
50——提取液總體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
5——第一次氨吹后復(fù)溶體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
v1——移取提取液體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
v2——除脂后移取下層清液體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
v3——第二次氮吹后復(fù)溶體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
m——試樣質(zhì)量的數(shù)值，單位為克（g）。
a——試樣溶液中吡啶甲酸鉻色譜峰面積；
as——標(biāo)準(zhǔn)溶液中吡啶甲酸鉻色譜峰面積；
cs——標(biāo)準(zhǔn)溶液中吡啶甲酸鉻質(zhì)量濃度的數(shù)值，單位為微克每毫升（μg/ml）；
50——提取液總體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
5——第一次氮吹后復(fù)溶體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
v1——移取提取液體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
v2——除脂后移取下層清液體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
v3——第二次氮吹后復(fù)溶體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
m——試樣質(zhì)量的數(shù)值，單位為克（g）。
添加劑預(yù)混合飼料試樣中吡啶甲酸鉻的含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω計(jì)，數(shù)值以毫克每千克（mg/kg）表示。多點(diǎn)校準(zhǔn)按公式（3）計(jì)算，單點(diǎn)校準(zhǔn)按公式（4）計(jì)算。
式中：
ρ——從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的試樣溶液中吡啶甲酸鉻的質(zhì)量濃度.單位為微克每毫升（μg/ml）；
50——提取液總體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
5——氮吹后復(fù)溶體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
v1——移取提取液體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
m——試樣質(zhì)量的數(shù)值，單位為克（g）。
a——試樣溶液中吡啶甲酸鉻色譜峰面積；
as——標(biāo)準(zhǔn)溶液中吡啶甲酸鉻色譜峰面積；
cs——標(biāo)準(zhǔn)溶液中吡啶甲酸鉻質(zhì)量濃度的數(shù)值，單位為微克每毫升（μg/ml）；
50——提取液總體積的數(shù)值。單位為毫升（ml）；
5——氮吹后復(fù)溶體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
v1——移取提取液體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
m——試樣質(zhì)量的數(shù)值，單位為克（g）。
測(cè)定結(jié)果以平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留3位有效數(shù)字。
10精密度
當(dāng)吡啶甲酸鉻含量≤05mg/kg時(shí)，在重復(fù)性條件下，2次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果與算術(shù)平均值的絕對(duì)差值不大于該算術(shù)平均值的15%。
當(dāng)吡啶甲酸鉻含量>0.5mg/kg時(shí)，在重復(fù)性條件下2次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果與其算術(shù)平均值的絕對(duì)差值不大于該算術(shù)平均值的10%。