凝膠滲透色譜-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定花生油中涕滅威及其代謝產(chǎn)物殘留量
吉文亮劉華良馬永建
江蘇省疾病預(yù)防控制中心，南京210009
《衛(wèi)生研究》2001年39卷04期
摘要：目的測定花生油中涕滅威及其代謝產(chǎn)物涕滅威亞砜和涕滅威砜殘留量。方法花生油樣品加入同位素內(nèi)標(biāo)d3-涕滅威后經(jīng)凝膠滲透色譜凈化和在線濃縮，以甲醇-10mmol/l乙酸銨溶液為流動相，經(jīng)hplc梯度分離后質(zhì)譜以多反應(yīng)監(jiān)測模式（mrm）測定。結(jié)果涕滅威亞砜和涕滅威砜的[m+h]+離子響應(yīng)zui強(qiáng)作為母離子,而涕滅威以[m+nh4]+作為母離子。涕滅威及其代謝產(chǎn)物的工作曲線線性范圍為5~250ng/ml，相關(guān)系數(shù)均優(yōu)于0.998（r2），涕滅威及涕滅威砜的檢出限為2.0μg/kg，涕滅威亞砜的檢出限為1.0μg/kg，在加標(biāo)濃度分別為10μg/kg和100μg/kg時的回收率為85.2％～117.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.59%～11.0%。結(jié)論建立的方法快捷、靈敏度高，可應(yīng)用于同時測定花生油中農(nóng)藥涕滅威及其代謝物涕滅威亞砜、涕滅威砜的殘留量。
關(guān)鍵詞：凝膠滲透色譜液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜涕滅威涕滅威亞砜涕滅威砜同位素內(nèi)標(biāo)花生油
determinationofaldicarbanditsmetabolitesinpeanutoilusinggelpermeationchromatography–highperformanceliquidchromatography–tandemmassspectrometry
jiwenliang,liuhualiang,mayongjian
jiangsuprovincialcenterfordiseasecontrolandprevention，nanjing210009，china
abstract:objectivetodeterminatealdicarbanditsmetabolitesaldicarbsulfoxideandaldicarb
sulfoneinpeanutoil.methodspeanutoilwaspurifiedwithgpcandconcentratedonlineafter
addingisotopicallylabeledstandardsasinternalstandards.thephasecomposedwithmethanol
and10mmol/lammoniumacetate.dataacquisitionwasachievedbyapplyingmultiplereactionmonitoring
oftwofragmentiontransitionstoprovideahighsensitivityandselectivityforbothquantification
andconfirmation.resluts.strongsignalscorrespondingto[m+h]+wereobservedforaldicarbsulfoxideandaldicarbsulfoneasparentions,except[m+nh4]+foraldicarbinoptimizedprocedure.thematrix-matchedcalibrationcurvesshowedgoodlinearityintherange5~250ng/mlwithcorrelationcoefficients
largerthan0.998（r2）.thelimitsofdetectionwere2.0μg/kgforaldicarbandaldicarbsulfone,1.0μg/kgforaldicarbsulfoxide.therecoverieswererangedfrom85.2％to117.4%withtherelativestandard
deviationrangedfrom7.59%to11.0%whenspikedlevelsat10μg/kgand100μ/kg.conclusionthemethodwassensitiveandselectivefordeterminationofaldicarbandits
metabolitesinpeanutoilsimultaneously.
keyword:gelpermeationchromatography,highperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry,aldicarb,aldicarbsulfoxide,aldicarbsulfone,isotopeinternalstandard,
peanutoil
作者簡介：吉文亮，碩士，副主任技師，（025）83759369；:jwl320911
涕滅威屬于氨基甲酸酯類農(nóng)藥，廣泛應(yīng)用于殺蟲、殺螨、除草等方面。同其它氨基甲酸酯類農(nóng)藥一樣，涕滅威在植物的代謝途徑有，首先是水解成氨基甲酸（carbamicacid），再分解成co2和胺。除水解外，還發(fā)生氧化反應(yīng)生成涕滅威亞砜和涕滅威砜兩種主要的毒性化合物。由于涕滅威及其氧化產(chǎn)物涕滅威亞砜、涕滅威的小鼠ld50分別為0.9mg/kg、0.9mg/kg和25mg/kg，均被認(rèn)為是毒理學(xué)上有重要意義的代謝物[1~3]，所以研究涕滅威在環(huán)境和農(nóng)作物中的殘留必須同時考慮涕滅威及其2個氧化產(chǎn)物。我國gb2763-2005中規(guī)定涕滅威及其亞砜、砜的和以涕滅威計(jì)，花生油中zui大殘留*為0.04mg/kg。日本肯定列表制度中，涕滅威的暫定標(biāo)準(zhǔn)0.05mg/kg，涕滅威亞砜和涕滅砜威（涕滅氧威）適用的是0.01mg/kg的“一律標(biāo)準(zhǔn)”。
目前我國關(guān)于花生油中涕滅威殘留量的測定方法參考gb/t14929.2-1994中《花生仁、棉籽油、花生油中涕滅威殘留量的測定方法》，用強(qiáng)酸將樣品中涕滅威和涕滅威亞砜氧化為涕滅威砜，以氣相色譜（fpd檢測器）進(jìn)行測定以響應(yīng)的代謝物涕滅威砜代替總量，但是目前上需要測定涕滅威及其亞砜和砜兩種代謝物，而且原有方法的靈敏度、選擇性和適用范圍等方面均不能滿足目前的檢測要求，難以適應(yīng)日益發(fā)展的社會需求?；谏鲜龅脑瓌t，同時結(jié)合目前測定涕滅威及其氧化產(chǎn)物測定方法的文獻(xiàn)[4~12]，且凝膠滲透色譜技術(shù)可用于復(fù)雜基質(zhì)樣品的凈化處理[13~16]，建立了凝膠滲透色譜-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定花生油中涕滅威及其代謝產(chǎn)物殘留量方法。
1材料與方法
1.1儀器
液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀：watersacquityuplc串聯(lián)quattromicromass三重四極桿質(zhì)譜（美國waters公司）：凝膠滲透色譜儀（帶在線濃縮裝置和紫外檢測器，德國lctech公司），s-x3凝膠色譜柱填料（美國bio－bead公司），氮吹儀（美國oi公司），0.45µm有機(jī)相濾膜（上海安普公司）。
1.2試劑
乙酸乙酯、環(huán)己烷、甲醇均為色譜純（美國merck公司）；乙酸銨（南京化學(xué)試劑廠，≥98.0%），超純水用millipore純水機(jī)制備所得。
1.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)
涕滅威（aldicarb，cas：116-06-3）、涕滅威亞砜（aldicarbsulfoxide，cas：1646-87-3）、涕滅威砜（aldicarbsulfone，cas：1646-88-4）和d3-涕滅威標(biāo)準(zhǔn)品均購自德國dr.ehrenstorfer公司（純度為98.5%）。
單標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取涕滅威、涕滅威亞砜、涕滅威砜各10mg，分別置于10ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。得到1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。4℃下可保存6個月。
混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：取適量的涕滅威、涕滅威亞砜、涕滅威砜標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用甲醇分別稀釋至含0、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00mg/ml涕滅威、涕滅威亞砜、涕滅威砜的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。臨用前配置
內(nèi)標(biāo)溶液：稱取d3-涕滅威適量用甲醇稀釋至0.1mg/ml貯備液，4℃冰箱中保存。使用前用甲醇稀釋至1.0mg/ml作為使用液。
1.4色譜條件
色譜柱為watersatlantisc18色譜柱（150mm×2.1mm，5mm），流動相a為甲醇；流動相b為10mmol/l乙酸銨溶液，梯度洗脫程序見表1，流速0.3ml/min，進(jìn)樣量10μl，柱溫：30℃。
表1液相色譜梯度洗脫條件
table1conditionofhplcgradientelution
phase：a，methanol；b，10mmol/lammoniumacetate
1.5質(zhì)譜條件
電噴霧正離子化源（esi+）；毛細(xì)管電壓3.5kv，離子源溫度100℃，霧化氣溫度300℃，脫溶劑氣500l/h，錐孔反吹氣20l/h，mrm監(jiān)測模式，具體條件見表2。
表2mrm分析的質(zhì)譜參數(shù)
table2analysisparamentsofmultiplereactionmonitoring
△定量離子*定性離子
1.6樣品處理
取2g花生油（至0.01g），加入0.10mld3-涕滅威內(nèi)標(biāo)使用液，用乙酸乙酯-環(huán)己烷（1+1,v/v）稀釋至10ml。取5.0ml進(jìn)凝膠滲透色譜凈化，待花生油峰出完后，立即開始收集洗脫液，收集1300s~2400s洗脫液，凝膠滲透色譜的具體參數(shù)見表3，洗脫液于50℃下減壓濃縮至5.0ml。得到的備用濃縮液相當(dāng)于含1.0g花生油。取出并進(jìn)一步濃縮至1.0ml，作為待測液。
表3凝膠滲透色譜技術(shù)參數(shù)
tablie3paramentsofgelpermeationchromatography
2結(jié)果
2.1涕滅威及其代謝產(chǎn)物涕滅威亞砜和涕滅威砜的分離
采用esi正離子模式掃描方式下，涕滅威m/z208[m+nh4]峰明顯，選擇m/z208為母離子，當(dāng)錐孔電壓10v，碰撞能量為14v時，子離子m/z116[m—ch3nhcoo]和m/z89[m—ch3nhcoonch，即（ch3）2sch3]信號zui強(qiáng)，其中m/z89有更強(qiáng)的信號，因此選擇208→116為定性離子，208→89為定量離子。同理涕滅威亞砜，選擇m/z207[m+h]為母離子，m/z207→132[m-ch3nhcoo]為定量離子,m/z207→89[-c（ch3）2sch3]為定性離子，錐孔電壓14v，碰撞能量為8v。涕滅威砜選擇m/z223[m+h]為母離子，m/z223→148[m-ch3nhcoo]為定量離子,m/z207→86[-o-n=ch-ch（ch3）2]為定性離子，錐孔電壓20v，碰撞能量為9v。d3-涕滅威m/z211→116為定性離子，m/z211→89為定量離子
涕滅威、涕滅威亞砜、涕滅威砜及d3-涕滅威的mrm離子流圖（圖1）。
圖1mrm模式下3種目標(biāo)化合物及d3-涕滅威的定量離子色譜圖
fig.1quantitativeionchromatographyof3standardsandd3-aldicarbinmrmmode
1.aldicarbsulfoxide2.aldicarbsulfone3.aldicarb4.d3-aldicarb
2.2方法的線性范圍和檢出限
取7份2g不含目標(biāo)化合物的空白花生油（至0.01g），分別加入0.10ml混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入0.10ml1.0mg/mld3-涕滅威內(nèi)標(biāo)使用液，按樣品處理方法（1.6）得濃縮液，每濃縮液含涕滅威、涕滅威亞砜和涕滅威砜的濃度分別為0、5、10、20、50、100、250ng/ml，作為工作溶液系列。分別進(jìn)樣10μl，以標(biāo)樣的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得到線性方程。以信噪比（s/n）為3作為檢出限（lod）。結(jié)果見表4.
表43種目標(biāo)化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)（r2）、檢出限
table4linearranges、linearequations、correlationcoefficients（r2）andlimitsofdetections（lod）
2.3精密度和回收率
稱取2g的花生油12份，分別添加10µg/kg、100µg/kg二個水平濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液后，按照樣品的處理方法凈化和濃縮處理，濃縮液進(jìn)樣分析，每個添加水平平行測定6份，回收率為85.2%～117.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.59%～11.0%，結(jié)果見表5。
表5方法的回收率（n=6）及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差
table5averagerecovery（n=6）andrsd
2.4樣品分析
對市場上花生油樣品進(jìn)行檢測，檢出結(jié)果均為陰性。樣品加標(biāo)測定時目標(biāo)化合物的保留時間、定性定量離子的比值均符合歐盟的規(guī)定[17]
3討論
3.1凝膠滲透色譜條件的選擇
用標(biāo)準(zhǔn)品通過gpc色譜柱時出峰的先后順序是涕滅威砜、涕滅威亞砜和涕滅威，加標(biāo)樣品通過gpc色譜柱時涕滅威砜的保留時間顯著提前，且緊挨著花生油峰，因此在樣品處理時綜合考慮花生油洗脫液收集時間從1300秒開始到2400s結(jié)束。三個目標(biāo)化合物的分子量從190到222，差距只有32，但在gpc上保留時間差距達(dá)到1100s，可能是花生油基質(zhì)的影響。
3.2液相色譜柱條件的選擇
由于涕滅威砜和涕滅威亞砜、涕滅威的極性相差較大，且涕滅威砜和涕滅威亞砜的極性較強(qiáng)，本文比較了waters公司的symmertyc18（150mm×2.1mm，5µm）柱和atlanisc18（150mm×2.1mm，5µm）柱。在現(xiàn)有的流動相條件下symmertyc18不能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物涕滅威砜和涕滅威亞砜的顯著分離，在atlantis柱上可實(shí)現(xiàn)*分離。同時還在現(xiàn)有條件下考察了shiseido公司的capcellcr（1：4）色譜柱（150mm×2.1mm，5µm）也可實(shí)現(xiàn)*分離。本文實(shí)驗(yàn)中采用atlantis柱。
3.3標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線和工作曲線的比較
本文在用標(biāo)準(zhǔn)曲線測定樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)時，涕滅威亞砜和涕滅威砜的回收率zui高達(dá)到200%，考慮到可能是樣品基質(zhì)的干擾，進(jìn)行了工作曲線實(shí)驗(yàn)，在不含目標(biāo)化合物的空白花生油中分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，按2.2項(xiàng)下的步驟開展實(shí)驗(yàn)，所得的曲線斜率對涕滅威亞砜和涕滅威砜而言顯著大于標(biāo)準(zhǔn)曲線，而對涕滅威由于同位素內(nèi)標(biāo)的存在沒有明顯的影響。詳見圖2。所以本實(shí)驗(yàn)采用工作曲線。
圖23個目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線和工作曲線
fig.2calibrationcurvesandmatrix-matchedcalibrationcurvesof3targetcompounds
1、aldicarb2、aldicarbsulfoxide3、aldicarbsulfone
■matrix-matchedcalibrationcurves◆calibrationcurves
本文建立的方法可同時測定花生油中涕滅威及其代謝產(chǎn)物涕滅威亞砜、涕滅威砜殘留量。該方法較現(xiàn)有的國標(biāo)gb/t14929.2-94僅測定涕滅威砜的氣相色譜方法定性定量更準(zhǔn)確，且檢出限均能滿足歐盟和日本肯定列表對代謝產(chǎn)物的*。
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