熱原系指由微生物產(chǎn)生的能引起恒溫動(dòng)物體溫異常升高的致熱物質(zhì), 它包括細(xì)菌性熱原、 內(nèi)源性高分子熱原、 內(nèi)源性低分子熱原及化學(xué)船原等。這里所指的“熱原”是指細(xì)菌性熱原(細(xì)菌內(nèi)毒素) ,其是某些細(xì)菌的代射產(chǎn)物、細(xì)菌尸體及內(nèi)毒素,即細(xì)菌性熱原是由細(xì)菌在生長(zhǎng)、 繁殖過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,以及細(xì)菌死亡后從細(xì)菌尸體中釋放出內(nèi)毒素等混合而成,主要成份是磷脂多醇與蛋白質(zhì)結(jié)合而成的復(fù)合物,磷脂多醇是復(fù)合物的活性中心,致熱作用強(qiáng), 其化學(xué)組成菌種不同而有所差異, 分子量為5x1o4~5x1o5, 分子量越大致熱作用也越強(qiáng)。 當(dāng)細(xì)菌存在于藥液中,并具備細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的條件,如水分、適宜細(xì)菌生長(zhǎng)的溫度與酸堿度,又有足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),細(xì)菌就會(huì)快速生長(zhǎng)繁殖,就有可能產(chǎn)生熱原。大多數(shù)細(xì)菌和霉菌都能產(chǎn)生熱原,致熱能力強(qiáng)的是革蘭氏陰性桿菌的產(chǎn)物,其次是革蘭陽性桿菌類,革蘭陽性球菌則較弱, 霉菌、酵母菌、甚至病毒也能產(chǎn)生熱原。當(dāng)注入人體的注射劑中含有熱原量達(dá)1 µg/kg就可引起不良反應(yīng),發(fā)熱反應(yīng)通常在注入1h后出觀,可使人體產(chǎn)生發(fā)冷、寒顫、發(fā)熱、出汗、惡心、 嘔吐等癥狀,有時(shí)體溫可升至4o 度以上,嚴(yán)重者甚至昏迷、虛脫,如不及時(shí)搶救,可危及生命。
鑒于注射劑中的熱原對(duì)人體的危害*, 故有必要對(duì)它的特征、 檢測(cè)方法、 污染途徑和去除方法進(jìn)行研究總結(jié) 。
1 注射劑中熱原的特征[1]
1.1 水落性
熱原能溶于水, 其濃縮液往往有乳光 。
1.2 耐熱性
熱原在60度干熱1h不受影響, 100 度也不會(huì)分解, 120度干熱4h能破壞98%左右,在18o-2oo 度干熱180min、250度干熱30 min、350 度干熱5min、650 度干熱1 min可徹底破壞,通常采用的注射劑濕熱滅菌條件下,熱原不能被破壞 。
1.3 過濾性
熱原體積小,為1~5 nm,能通過一般的除菌器,不能截留除去,但用小于1 nm，孔徑的孔濾膜或超過過濾器、1ll1濾過, 則可濾去絕大部分甚至全部熱原 。
1.4 不揮發(fā)性
熱原本身不揮發(fā),、溶于水,但可隨水蒸氣的霧滴夾帶入蒸餾水中,故蒸餾水器均設(shè)隔膜裝置。
1.5 可吸附性
熱原能被活性碳、白陶土、石硅藻土等吸附,但屬非特異性吸附,藥物也會(huì)被吸附附而損失。同時(shí),可被離子交換樹脂, 尤其陰離子交換樹脂所交換而除去 。
1.6 可破壞性
熱原可被強(qiáng)堿、強(qiáng)酸、氧化劑等破壞,故可用強(qiáng)堿或強(qiáng)酸，清潔液來處理帶熱源的容器具。
2注射劑中熱原的檢測(cè)方法
2.1家兔法[2]
由于家兔對(duì)熱原的反應(yīng)與人基本相似,家兔法為各國(guó)藥典規(guī)定的檢查熱原的法定方法。
2015版《中國(guó)藥典》規(guī)定的熱原檢查法系將一定劑量的供試品,靜脈注入家兔體內(nèi),在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況,以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。
檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性和一致性取決于試驗(yàn)動(dòng)物的狀況、試驗(yàn)室條件和操作的規(guī)范性。家兔法檢測(cè)內(nèi)毒素的靈敏度0.001μg/nl,試驗(yàn)結(jié)果接近人體真實(shí)情況,但操作繁瑣、費(fèi)時(shí),不能用于注射劑生產(chǎn)過程中的質(zhì)量監(jiān)控,且不適用放射性藥物、腫瘤抑制劑等細(xì)胞毒性藥物制劑。
2.2細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法(鱟試劑法)[2]
細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法系利用鱟試劑來檢測(cè)或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)的細(xì)菌毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種辦法。細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位(eu)表示。
細(xì)菌內(nèi)毒素檢查包括凝膠法和光度測(cè)定法兩種方法,前者利用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來檢測(cè)或半定量?jī)?nèi)毒素,后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法,系分別利用鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化及產(chǎn)生的疑固酶使特定底物釋放出呈色團(tuán)的多少來測(cè)定內(nèi)毒素。
鱟試劑法檢查內(nèi)毒素的靈敏度為0.0001μg/ml,比家兔法靈敏10倍，操作簡(jiǎn)單易行,試驗(yàn)費(fèi)用低,結(jié)果迅速可靠,適用于注射劑生產(chǎn)過程中的熱原控制和家兔法不能檢測(cè)的某些細(xì)胞毒性藥物制劑,但其對(duì)革蘭陰性菌以外的內(nèi)毒素不靈敏,鱟試劑法尚不能完全代替家兔法。
鱟試劑法中使用的鱟試劑是由海洋生物鱟的血液變形細(xì)胞溶解物制成的無菌;冷凍干燥品，含有能被微量細(xì)菌內(nèi)毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固蛋白原，是從棲生于海洋的節(jié)肢動(dòng)物“鱟”的藍(lán)色血液中提取變形細(xì)胞溶解物，經(jīng)低溫冷凍干燥而成的生物試劑，能夠準(zhǔn)確，快速地定性或定量檢測(cè)樣品中是否含有細(xì)菌內(nèi)毒素和(1,3)-β-葡聚糖。鱟試劑法是上至今為止檢測(cè)內(nèi)毒素好的方法,它簡(jiǎn)單、快速、靈敏、準(zhǔn)確,因而被歐美藥典及我國(guó)藥典定為法定內(nèi)毒素檢查法,并已被世界各國(guó)所采用。
3注射劑污染熱原的途徑
3.1生產(chǎn)過程中操作人員帶入
在生產(chǎn)注射劑過程中,操作人員如果不按要求進(jìn)行著裝和操作,就有可能污染已處理好的生產(chǎn)環(huán)境、生產(chǎn)設(shè)備及附屬系統(tǒng)和藥液，進(jìn)而把熱原帶入到了注射劑中。
3.2生產(chǎn)過程中生產(chǎn)設(shè)備及附屬系統(tǒng)帶入
在生產(chǎn)注射劑時(shí),生產(chǎn)注射劑的設(shè)備、管道、濾器、容器、用具等,使用前未徹底清洗、滅菌和除盡熱原,均有可能污染熱原。
3.3原輔料帶入
某些原輔料,如中藥提取物、蔗糖、含蛋白為主生物制品等,由于細(xì)菌容易繁殖而引起熱原污染。原鋪料被熱原污染的原因很多,如包裝不符合要求、包裝出觀破損或存日久,以及許多藥品本身適于微生物生長(zhǎng),所以,在選用原輔料時(shí)應(yīng)加注意。
3.4由溶劑帶入
注射用水含熱原是注射劑污染熱原的主要來源。由于蒸餾器結(jié)構(gòu)不合理,操作不當(dāng),容器不潔,放置時(shí)間過久等都會(huì)污染熱原。注射劑的配制，溶劑好是新鮮制備的溶劑,如注射用水貯藏時(shí)間過久,被細(xì)菌污染后,細(xì)菌很快繁殖,短時(shí)間內(nèi)可產(chǎn)生大量熱原,雖然隨后還有滅菌操作,但是已有熱原存在,不易除去,因而產(chǎn)生熱原反應(yīng)。所以，配制注射劑時(shí)應(yīng)用新鮮注射用水,好隨制隨用,2010版gp中規(guī)定注射用水可采用70℃以上保溫循環(huán)存放。
3.5由生產(chǎn)工藝帶入
生產(chǎn)工藝中制定去除熱原的參數(shù),如溫度、時(shí)間、酸堿濃度、膜孔徑等制定的不正確,導(dǎo)致無法徹底除去生產(chǎn)設(shè)備及附屬系統(tǒng)、接觸藥液的內(nèi)包裝材料和藥液半成品中的熱原而造成注射劑的污染。
3.6生產(chǎn)過程中環(huán)境帶入
注射劑的整個(gè)生產(chǎn)過程要求在規(guī)定的潔凈環(huán)境中進(jìn)行,盡可能減少微生物污染的機(jī)會(huì),注射劑的潔凈生產(chǎn)環(huán)境按2010版g中規(guī)定一般分為a級(jí)、b級(jí)、c級(jí)、ⅳ級(jí),如果生產(chǎn)環(huán)境不符合g的要求,就增加了污染的風(fēng)險(xiǎn)。
3.7臨床應(yīng)用前帶入
注射劑成品在保過往中,由于操作不當(dāng),造成注射劑的內(nèi)包裝損壞壞,污染了注射劑而產(chǎn)生熱原。
3.8從輸液器中帶入
有時(shí)注射劑本身雖不含熱原,但注射后卻有熱原反應(yīng),這很可能是由于輸液用具污染產(chǎn)生的熱原,輸液用具包括一次性輸液器，一次性輸液管等。
3.9在注射過程中帶入
(1)輸液中加入其他藥物時(shí),如所加藥物本身已污染熱原;(2)加藥時(shí)操作室的潔凈度差,環(huán)境不符合要求,消毒及操作違規(guī);(3)加藥后放置時(shí)間長(zhǎng),增加了污染的風(fēng)險(xiǎn)
4 注射劑重?zé)嵩娜コ椒?br>4.1 利用熱原的水溶性去除熱原
4.1.1 密閉的生產(chǎn)設(shè)備系統(tǒng)
采用在線清洗/滅菌的方法，用新鮮注射用水在線清晰15分鐘，在線121度滅菌15分鐘的方法建立無熱原無菌的密閉生產(chǎn)系統(tǒng)。
4.1.2 生產(chǎn)用容器具
不能在線清洗，在線滅菌的生產(chǎn)用容器具，用新鮮注射用水清洗15分鐘，使用濕熱滅菌柜121度滅菌15min或者115度，30min的方法，使之無熱原無菌。利用在線沖洗和在線滅菌相結(jié)合的方式去除熱原，雖然操作方便，但是會(huì)浪費(fèi)大量的注射用水。
4.2 利用熱原不耐干熱的特性去除熱原
對(duì)能耐受高溫處理的制藥用生產(chǎn)用容器具采用180-200度干熱180min，250度干熱5min的方清除生產(chǎn)用容器具的熱原。
4.3 利用熱原體積為1-5nm的特性去除熱原
采用用小于1nm孔徑的微孔濾膜或超過濾器濾過藥液除去液體里的熱原。
4.4 利用熱原的可吸附性去除熱原
常選用活性炭(針劑用)、白陶土、硅藻土吸附藥液里里的熱原。但是,使用活性炭吸附熱原時(shí)需要注意一些事項(xiàng)：(1)活性炭的臨界吸附溫度為45-50度，當(dāng)溫度低于臨界吸附溫度時(shí)活性炭的吸附效力力較差差,使用時(shí)除需冷藏和
不便加熱的藥液外,一般采用加熱煮沸后吸附15-30min，,冷至45-50℃時(shí)濾過脫炭,脫炭好在短時(shí)間內(nèi)完成，以免溫度下降或在放置過程中發(fā)生脫吸附作用,使制劑雜質(zhì)增多。
(2)活性炭的用量應(yīng)視原料質(zhì)量，品種而定，常用量為0.1-0.5%(w/v)，若用量不足,對(duì)雜質(zhì)，熱原燈不能完全吸附,用量過大,其所含的水溶性雜質(zhì)可對(duì)藥液造成污染,影響制劑質(zhì)量?；钚蕴康挠昧颗c活性炭的吸附力、活性炭對(duì)藥物的吸附力,溶媒的性質(zhì)、藥物的結(jié)構(gòu)等因素都有關(guān)系?；钚蕴吭谒斜仍谟袡C(jī)溶媒中的吸附力強(qiáng);對(duì)極性基團(tuán)多的化合物的吸附力大于對(duì)極性基團(tuán)少的化合物;對(duì)芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物;對(duì)分子量大的化物吸附力大于分子量小的化合物。因此對(duì)主藥含量低或主藥易被活性炭吸附的制劑,活性炭的用量好控制在0.05%(w/v),并通過計(jì)算適當(dāng)增加主藥投料量。
4.5利用熱原這類大分子上含磷酸根與羧酸根特性去除熱原
熱原這類大分子上含磷酸根與羧酸根特性往往帶有負(fù)電荷,故易被強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂所交換,采用離子交換出去藥液里的熱原。
4.6利用熱原可被強(qiáng)硪、強(qiáng)酸、氧化劑等破壞的特性去除熱原
使用強(qiáng)堿或強(qiáng)酸來處理帶熱原的制藥用生產(chǎn)設(shè)備及附助系統(tǒng)、容器具,具體方法是使用低濃度的強(qiáng)堿(如1%的氫化鈉溶液)或強(qiáng)酸對(duì)配液罐及其管道、容器具浸泡8h,用高濃度的強(qiáng)堿(如10%的氫氧化鈉溶液)或強(qiáng)酸對(duì)配液罐及其管道、容器具進(jìn)行擦拭,存放8h,就可以除去生產(chǎn)設(shè)備及附助系統(tǒng)、容器具上的熱原。這種方法的缺點(diǎn)是浪費(fèi)時(shí)間,優(yōu)點(diǎn)是能夠節(jié)省大量的注射用水
4.7利用凝膠過濾法除去熱原
凝膠為一分篩，利用熱原與藥物分子量的差異,將兩者分開，當(dāng)兩者分子量相差不大時(shí),不宜使用。
4.8利用反滲透法除去熱原
用醋酸較纖維素膜和聚酰胺膜制備注射用水可除去制藥用注主射用水中的熱原,與蒸餾法相比,具有節(jié)約熱能和冷卻水的優(yōu)點(diǎn)。
5 結(jié)語
本文對(duì)注射劑中熱原的特征、檢測(cè)方法、污染途徑及去除方法進(jìn)行了研究、分析和總結(jié)，為解決注射劑生產(chǎn)遇到的熱原問題提出了多種有效的解決方法，在實(shí)際操作過程中，可以根據(jù)不同的物品、不同的品種選用不同的去除熱原方法，既保證了藥品質(zhì)量，又給企業(yè)帶來了效益。
參考文獻(xiàn)：
原著：曲 晶，劉永剛，姜大公. 注射劑中熱原的特征、檢測(cè)方法、污染途徑及去除方法研究.中國(guó)制藥裝備[j].總148期.2017(12)
作者簡(jiǎn)介：曲 晶，吉林敖東洮南藥業(yè)股份有限公司，吉林 洮南 137100;劉永剛，吉林通化金馬藥業(yè)股份有限公司，吉林 通化 134001;姜大公，山東威高藥業(yè)股份有限公司，山東 威海 264200
本文綜合整理自：中國(guó)制藥機(jī)械技術(shù)網(wǎng)
原標(biāo)題：注射劑中熱原的特征、檢測(cè)方法、污染途徑及去除方法研究