用于高通量篩選的斑馬魚(yú)的新型成像和分析
by jayne hesley, evan cromwell, paula rickert gedraitis, grischa chandy, michael sjaastad, and timothy baranowski1mds analytical technologies (us) inc., sunnyvale, california zygogen llc, atlanta, georgia1
摘要
大型生物體，如斑馬魚(yú)胚胎，已成為開(kāi)發(fā)用于藥物發(fā)現(xiàn)和毒理學(xué)研究的疾病相關(guān)檢測(cè)的有吸引力的模型系統(tǒng)。執(zhí)行這些檢驗(yàn)的一個(gè)限制是要有快速圖像采集系統(tǒng)，該系統(tǒng)要具有足夠的分辨率和景深來(lái)準(zhǔn)確表征此類生物體。第二個(gè)限制是對(duì)復(fù)雜圖像的分析，以提供對(duì)測(cè)定中感興趣的生物學(xué)特征的快速和準(zhǔn)確的量化。此處，我們報(bào)告了isocyte® 激光掃描成像儀用于三維目標(biāo)的高通量圖像采集，同時(shí)結(jié)合metaxpress®和acuityxpress®軟件應(yīng)用程序，用于可視化和數(shù)據(jù)分析。專有的光學(xué)系統(tǒng)具有大景深（400 μm），可以在不到5分鐘的時(shí)間內(nèi)為每個(gè)微孔板采集全孔圖像。圖像是在兩個(gè)激光散射中同時(shí)獲得的，它提供了物體的無(wú)標(biāo)記圖像，以及最多三個(gè)其他熒光通道（例如，綠色熒光蛋白標(biāo)記的血管）。此處將介紹384 孔板格式的兩個(gè)應(yīng)用程序。在一個(gè)例子中，分析了用于鑒定影響血管生成血管的治療劑的活z-tag斑馬魚(yú)胚胎(zygogen)。在另一個(gè)例子中，測(cè)試了一組物質(zhì)不同劑量對(duì)發(fā)育中的斑馬魚(yú)胚胎的急性毒性作用。結(jié)果表明，使用組合的數(shù)據(jù)采集和分析軟件可以快速準(zhǔn)確地對(duì)血管進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且可以快速測(cè)量對(duì)形態(tài)學(xué)的毒性影響。
簡(jiǎn)介
斑馬魚(yú)為測(cè)試化合物的效果提供了一個(gè)有吸引力的模型，因?yàn)樗鼈兘Y(jié)合了基于細(xì)胞的檢測(cè)的通量和動(dòng)物模型的生物學(xué)相關(guān)性。由于斑馬魚(yú)胚胎在頭5 天內(nèi)發(fā)育出大部分主要器官系統(tǒng)，并且具有可滲透的、透明的皮膚很容易使感興趣的特定組織可視化，尤其是在熒光報(bào)告蛋白的幫助下。本研究調(diào)查了1）血管生成抑制化合物（vatalanib/ptk787）對(duì)在其脈管系統(tǒng)中表達(dá)綠礁珊瑚熒光蛋白的發(fā)育中的胚胎尾部血管形成的劑量依賴性影響；2）不同劑量已知毒性化合物處理24小時(shí)對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的長(zhǎng)度和形態(tài)的影響。為了在篩選場(chǎng)景中有效利用胚胎，將它們活著分配到384孔微孔板的孔中，加入藥物，并在isocyte®dl激光掃描成像儀上進(jìn)行掃描。同步獲取的圖像能顯示熒光信號(hào)和激光散射（類似于明場(chǎng)）信號(hào)。生成的圖像在采集過(guò)程中“即時(shí)”分析，或?qū)雖etaxpress®軟件進(jìn)行分析。
材料和方法
z-tagsm血管生成試驗(yàn)入門(mén)試劑盒（zygogen）
z-tag熒光血管胚胎（zygogen）
二甲基亞（sigma, pn 276855）
乙醇（sigma, pn 459836）
馬拉息昂（spectracide 50%）
六氯酚（sigma pn 4-0323）
三聚氰胺（beacon analytical, pn 20-0158）
384孔玻璃底微孔板（matrical, mgb1011-hg）
血管生成分析程序
在進(jìn)行運(yùn)輸前，受精1天后的胚胎用zygogen進(jìn)行酶解脫氯，用不同劑量的vatalanib/ptk787或1%二甲基亞砜進(jìn)行處理。收到后，384孔透明底板每孔加入60ul溶液并置入一個(gè)胚胎。胚胎按照每個(gè)劑量5-8復(fù)孔按列排列。在孔板內(nèi)平衡2小時(shí)后，胚胎用2.5ul0.4%的三卡因麻醉。30分鐘后，斑馬魚(yú)32g離心1分鐘，使其平鋪在孔板底部。受精2天后的魚(yú)用isocyte成像儀進(jìn)行掃描，設(shè)置如表1。
表1. 用于斑馬魚(yú)掃描的isocytetm儀器設(shè)置
isocyte設(shè)置
血管生成分析
急性毒性分析
激發(fā)光源
488納米激光
488納米激光
gfp發(fā)射
510-540納米
510-540納米
激光掃描發(fā)射
475-485納米
475-485納米
掃描面積
3200×3200微米（比整孔大10%）
3200×3200微米（比整孔大10%）
分辨率
5×5微米
5×5微米
數(shù)據(jù)平均
2均值/像素
1均值/像素
isocyte數(shù)據(jù)除了保存為mdcstoretm（數(shù)據(jù)庫(kù)）兼容的單個(gè)tif文件外，還自動(dòng)保存為一平板原始圖像。將tif圖像從數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)入到metamorph®或metaxpress®軟件中，使用包含神經(jīng)突生長(zhǎng)模塊的簡(jiǎn)單期刊進(jìn)行分析，該模塊適用于計(jì)數(shù)從尾巴主血管發(fā)芽的熒光血管。
圖1. metaxpress®軟件中的神經(jīng)突生長(zhǎng)模塊
急性毒性分析程序
胚胎在受精1天后由zygogen去氯離子。在受精2天后收到，按384孔板每孔1個(gè)胚胎轉(zhuǎn)移到40 ul的溶液中。胚胎按照每個(gè)劑量7復(fù)孔按列排列。將40ul 2倍濃度的6種化合物加入適當(dāng)?shù)奶幚砜字校⑴咛ピ?8℃下孵育24小時(shí)。掃描前30分鐘，通過(guò)加入5ul的0.4%三卡因麻醉胚胎。將魚(yú)在32g下離心1分鐘以使其平鋪在孔底，受精3天后的魚(yú)用isocyte成像儀進(jìn)行掃描，儀器設(shè)置如表1。
isocyte®數(shù)據(jù)除了保存為mdcstoretm（數(shù)據(jù)庫(kù)）兼容的單個(gè)tif文件外，還自動(dòng)保存為一平板原始圖像。將tif圖像從數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)入metaxpress®軟件進(jìn)行分析，使用journal進(jìn)行分析，該journal使用組合的熒光和散射圖像創(chuàng)建掩模（mask），然后報(bào)告形態(tài)測(cè)量參數(shù)（例如長(zhǎng)度）以及強(qiáng)度測(cè)量。
結(jié)果
血管生成分析
整個(gè)384孔板在isocyte®成像儀上掃描并保存在8分鐘內(nèi)完成。熒光和散射圖像可以在采集時(shí)查看。參見(jiàn)圖2，查看具有vatalanib劑量反應(yīng)的斑馬魚(yú)gfp圖像的示例。
圖2.在增加vatalanib劑量的熒光圖像中尾血管分支發(fā)育的抑制很明顯。
用戶可以選擇在isocyte成像儀上掃描后要自動(dòng)保存的6種不同文件類型中的哪一種。該掃描被保存為單個(gè)680 mb原始數(shù)據(jù)文件（384孔中的2個(gè)波長(zhǎng)）和tif圖像文件夾，以便于導(dǎo)入metamorph®軟件。創(chuàng)建了一個(gè)metamorph®分析journal，該journal裁剪了圖像并利用neurite outgrowth應(yīng)用模塊來(lái)識(shí)別和定量尾部的熒光血管。圖3顯示了分析的步驟。用journal自動(dòng)分析整個(gè)孔板的圖像，并將數(shù)據(jù)輸出記錄到數(shù)據(jù)庫(kù)文件或excel電子表格中。
圖3.metamorph®血管生成圖像分析示意圖。
繪制了計(jì)數(shù)血管的數(shù)量。圖4顯示了根據(jù)dmso對(duì)照校正的平均結(jié)果。誤差線表示重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。對(duì)血管形成的抑制與在zygogen觀察到的結(jié)果一致。
圖4. 隨著藥物劑量的增加，尾血管形成減少。
急性毒性分析
由于急性毒性測(cè)定依賴于胚胎體內(nèi)的顯而易見(jiàn)的形態(tài)變化，因此在掃描過(guò)程中沒(méi)有進(jìn)行像素平均，并且在4分鐘內(nèi)對(duì)整個(gè)384孔板進(jìn)行了成像和保存。圖5是在isocyte成像儀上采集的gfp和散射圖像的疊加圖。
圖5. 隨著劑量的增加，毒性作用是可見(jiàn)的。激光散射信號(hào)增加而gfp強(qiáng)度降低。
通常，急性毒性作用被測(cè)量為由于生病胚胎發(fā)育遲緩或卷曲而導(dǎo)致的總胚胎長(zhǎng)度差異。這種分析可以通過(guò)將isocyte圖像導(dǎo)入metaxpress®軟件并使用集成形態(tài)測(cè)量分析來(lái)測(cè)量長(zhǎng)度來(lái)完成。將長(zhǎng)度平均值與采集過(guò)程中分析的圖像的散射強(qiáng)度進(jìn)行比較。圖6表明，在這種情況下，散射強(qiáng)度是急性毒性的最佳指標(biāo)。圖7顯示了使用isocyte軟件測(cè)定的總激光散射信號(hào)對(duì)6種化合物的毒性影響。
圖6. 隨著劑量的增加，毒性作用是可見(jiàn)的。激光散射信號(hào)增加比魚(yú)長(zhǎng)減少更明顯。
圖7. 激光散射信號(hào)顯示了6種不同化合物的毒性作用的比較。
總結(jié)
isocyte®激光掃描成像儀非常適合在激光散射和熒光中同時(shí)快速采集斑馬魚(yú)圖像，而無(wú)需耗時(shí)的聚焦步驟。使用isocyte軟件的即時(shí)分析實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)斑馬魚(yú)毒性篩查。使用metaxpress®軟件和現(xiàn)有應(yīng)用模塊以半自動(dòng)方式完成血管生成的復(fù)雜圖像處理。