中華人民共和國國家標準
農(nóng)業(yè)部1862號公告-3-2012
飼料中萬古霉素的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法
determination of vancomycin in feeds-
liquid chromatography-tandem mass spectrometry
前言
本標準按照gb/t 1.1給出的規(guī)則起草。
本標準由農(nóng)業(yè)部畜牧業(yè)司提出。
本標準由全國飼料工業(yè)標準化技術(shù)委員會(sac/tc 76)歸口。
本標準起草單位；河南省飼料產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗站。
本標準主要起草人：班付國、吳寧鵬、彭麗、張發(fā)旺、周紅霞、李慧素。
1范圍
本標準規(guī)定了飼料中萬古霉素含量測定的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。
本標準適用于配合飼料、濃縮飼料、精料補充料和添加劑預混合飼料中萬古霉素的測定。
本標準的檢測限為0.05 mg/kg，定量限為0. 1 mg/kg。
2規(guī)范性引用文件
下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。
gb/t 6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
gb/t 14699.1飼料采樣
gb/t 20195動物飼料試樣的制備
3原理
以0.05 mol/l磷酸鹽緩沖液+乙臘（85+15）提取樣品中的萬古霉素，提取液經(jīng)強陽離子交換固相萃取柱凈化，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行測定，基質(zhì)匹配標準曲線校正，外標法定量。
4試劑和材料
除特殊注明外，本法所用試劑均為分析純，水符合gb/t 6682中一級水的規(guī)定。
4.1鹽酸萬古霉素對照品：純度≥80.0%。
4.2乙腈：色譜純。
4.3甲醇：色譜純。
4.4甲酸：色譜純。
4.5氨水。
4.6鹽酸。
4.7磷酸二氫鉀。
4.8磷酸。
4.9 0.05mol/l磷酸鹽緩沖液：稱取6.80g磷酸二氫鉀，用水溶解并稀釋至1000ml，用磷酸調(diào)節(jié)ph= 3.20±0.05，即得。
4.10提取液：取磷酸鹽緩沖液850 ml，加乙腈150 ml，混勻，即得。
4.11 0.1%甲酸水溶液：取甲酸1.0 ml加水稀釋至1 000 ml，混勻，即得。
4.12 0.1mol/l鹽酸溶液：取鹽酸9.0ml，加水稀釋至1000ml，混勻，即得。
4. 13 3%氨化甲醇溶液：取氨水3 ml，加入甲醇稀釋至100 ml，混勻，即得。
4.14強陽離子交換固相萃取柱：6 ml，200 mg，粒徑33μm，孔徑8.5 mm；或相當者。
4.15標準儲備溶液(1mg/ml)：準確稱取適量的鹽酸萬古霉素對照品，用水溶解并定容，配制成1 mg/ml的標準儲備液。-20℃下保存，有效期為3個月。
4.16標準工作液(10 ng/ml)：準確移取標準儲備液適量，用水稀釋成濃度為10μg/ ml的標準工作液。4℃下保存，有效期為1周。
5儀器和設(shè)備
除實驗室常用儀器和設(shè)備外，實驗還需用如下裝置：
a)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)。
b)分析天平：感量0.01 mg。
c)天平：感量0.01 g。
d)離心機：可達8000 r/min(相對離心力為7012 g)。
e)渦旋混合器。
f)水平振蕩器。
g)超聲清洗器。
h)固相萃取裝置。
i)氮吹儀。
6采樣和試樣制備
按gb/t 14699.1抽取有代表性的飼料樣品，用四分法縮減取約200g。按照gb/t 20195規(guī)定的方法制備樣品，粉碎后過0.45mm孔徑的分析篩，混勻，裝入磨口瓶中，備用。
7測定步驟
7.1提取
稱取試樣2g(精確至0.01 g)于50 ml離心管中，準確加入提取液20 ml，渦旋混合后振蕩10min，超聲提取10 min，期間搖動2次。取出后，于離心機上8000 r/min離心5 min，取上清液，備用。
7.2凈化
固相萃取柱依次用甲醇和0.1mol/l鹽酸各3ml活化，準確移取上清液5ml過柱。用甲醇3ml淋洗，抽干。3%氨化甲醇溶液3ml洗脫，收集洗脫液，于40℃下氮氣吹干。準確加入0.1%甲酸水溶液1ml溶解定容，渦動混勻，過0.22μm微孔濾膜，上lc-ms/ms測定。
7.3基質(zhì)匹配標準曲線的制備
準確移取萬古霉素標準溶液適量，依次加入同類基質(zhì)的空白樣品中，分別制得濃度為50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg、400μg/kg、1 000μg/kg、2 000μg/kg的系列空白添加試料。經(jīng)7.1~7.2步驟處理，制得理論濃度為25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml.500 ng/ml、1 000 ng/ml的基質(zhì)匹配標準溶液，過濾后上機測定。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標、標準溶液濃度為橫坐標，繪制基質(zhì)匹配標準曲線。
7.4測定
7.4.1色譜參考條件
色譜柱：c18柱，柱長100 mm，柱內(nèi)徑2.1 mm，粒度1.7μm；或相當?shù)姆治鲋?br>柱溫：40℃。
流動相：a相：0.1%甲酸溶液；b相：乙腈。梯度洗脫，梯度見表1。
流速：0.30 ml/min。
進樣量：10μl。
7.4.2質(zhì)譜參考條件
離子源：電噴霧離子源。
掃描方式：正離子掃描。
檢測方式：多反應監(jiān)測mrm。
電離電壓：3.2 kv。
源溫：110℃。
霧化溫度：400℃。
錐孔氣流速：50 l/h。
霧化氣流速：700 l/h。
定性離子對、定量離子對及對應的碰撞能量參考值見表2。
7.4.3定性測定
萬古霉素選擇1個母離子和2個特征離子，在相同試驗條件下，樣品中待測物質(zhì)的保留時間與標準溶液中對應的保留時間偏差在±2.5%之內(nèi)，且樣品中各組分定性離子的相對豐度與濃度接近的標準溶液中對應的定性離子的相對豐度進行比較，偏差不超過表3規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對應的待測物。
7.4.4定量測定
在儀器最佳工作條件下，對基質(zhì)匹配標準溶液進樣，以峰面積為縱坐標、基質(zhì)匹配標準溶液依度為橫坐標繪制工作曲線，用單點或多點對樣品進行定量，樣品溶液中待測物的響應值均應在儀器測定的線性范圍內(nèi)。上述色譜和質(zhì)譜條件下，基質(zhì)匹配標準溶液特征離子質(zhì)量色譜圖參見圖a.1。
8結(jié)果計算和表示
8.1結(jié)果計算
試樣中萬古霉素含量x以質(zhì)量分數(shù)計，單位為毫克每千克(mg/kg)，按式(1)計算：
式中：
a——試樣溶液中萬古霉素的峰面積；
as——標準工作液中萬古霉素峰面積；
cs——標準工作液中萬古霉素濃度，單位為微克每毫升(μg/ml)；
v——上機前最終定容體積，單位為毫升(ml)；
m——樣品的質(zhì)量，單位為克(g)；
v1——提取液中加入spe小柱的體積，單位為毫升(ml)；
v2——總提取液體積，單位為毫升(ml)；
n——稀釋倍數(shù)。
8.2結(jié)果表示
測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
9重復性
在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的20%。