細(xì)胞培養(yǎng)物解離是細(xì)胞培養(yǎng)物維持的關(guān)鍵步驟。它涉及將細(xì)胞從其生長(zhǎng)表面分離以進(jìn)行傳代培養(yǎng)或收獲。本節(jié)概述了兩種主要方法：使用無(wú)酶解離緩沖液和使用酶試劑。
1. 使用無(wú)酶細(xì)胞解離緩沖液該方法非常溫和，無(wú)需使用酶即可保持細(xì)胞完整性：
準(zhǔn)備
確保所有試劑在使用前加熱至 37°c，以避免對(duì)細(xì)胞造成沖擊。
去除生長(zhǎng)培養(yǎng)基：
從培養(yǎng)容器中丟棄舊的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
漂洗
每個(gè) t75 燒瓶或 100 mm 培養(yǎng)皿用 5 ml 不含鈣和鎂的 pbs 沖洗細(xì)胞單層。
在室溫下輕輕搖動(dòng)容器 30 至 60 秒。
吸出并丟棄沖洗溶液。
再次重復(fù)此沖洗步驟。
解離
將大約 5 ml 無(wú)酶細(xì)胞解離緩沖液添加到容器中。
在室溫下輕輕搖動(dòng) 1 至 2 分鐘，然后在顯微鏡下檢查解離情況。
如有必要，用手輕敲燒瓶或培養(yǎng)皿以去除細(xì)胞。
如果細(xì)胞貼壁，讓它們?cè)谑覝叵略凫o置 2 至 5 分鐘，并根據(jù)需要再次敲擊，使用更多的解離緩沖液。
細(xì)胞分離后，添加至少 5 ml 全生長(zhǎng)培養(yǎng)基以中和解離緩沖液并重懸細(xì)胞。
活力檢查
在傳代培養(yǎng)過(guò)程中監(jiān)測(cè)細(xì)胞活力，確保其保持在 90% 以上。
2. 使用其他試劑進(jìn)行解離該方法允許使用各種解離試劑：
去除用過(guò)的介質(zhì)
丟棄培養(yǎng)容器中的舊介質(zhì)。
洗滌細(xì)胞
用不含鈣和鎂的平衡鹽溶液清洗細(xì)胞，或使用 edta。
將洗滌液輕輕添加到細(xì)胞對(duì)面，并搖動(dòng)容器 1 至 2 分鐘，然后丟棄洗滌液。
解離
每 25 平方厘米的生長(zhǎng)表面涂抹 2 至 3 毫升所選的解離溶液，確保覆蓋細(xì)胞片層。
將容器在 37°c 下孵育并輕輕搖動(dòng)。解離通常發(fā)生在 5 至 15 分鐘內(nèi)，具體取決于細(xì)胞系。
對(duì)于頑固的細(xì)胞，敲擊容器可以加快這一過(guò)程。
仔細(xì)觀察細(xì)胞以防止過(guò)度暴露和潛在的損壞。
收獲細(xì)胞
一旦細(xì)胞分離，將其直立，讓它們收集在容器底部。
添加完整的培養(yǎng)基，然后通過(guò)移液到細(xì)胞層上分散并收集細(xì)胞。
計(jì)數(shù)并繼續(xù)傳代。
在這兩種方法中，重要的是通過(guò)經(jīng)驗(yàn)觀察確定每個(gè)細(xì)胞系的最佳條件。該過(guò)程應(yīng)保留細(xì)胞活力，在傳代培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)定期檢查細(xì)胞活力是否超過(guò) 90%。這些程序?yàn)檠芯咳藛T根據(jù)其細(xì)胞系的具體要求和特征進(jìn)行調(diào)整奠定了基礎(chǔ)。