中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)
gb 31656.1-2021
食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)
水產(chǎn)品中甲苯咪唑及代謝物殘留量的測定
高效液相色譜法
national food safety standard-
determination of mebendazole and its metabolites residue in fishery
products by high performance liquid chromatography
1范圍
本文件規(guī)定了水產(chǎn)品中甲苯咪唑及其代謝物氨基甲苯咪唑羥基甲苯咪唑殘留檢測的制樣和液相色譜測定方法。
本文件適用于魚、蝦和蟹可食組織中甲苯咪唑及其代謝物氨基甲苯咪唑和羥基甲苯咪唑殘留量的檢測。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性利用而構(gòu)成本文件必不可（ke）少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件，不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
gb/t 6682分析實(shí)驗(yàn)用水規(guī)則和試驗(yàn)方法
gb/t 30891-2014水產(chǎn)品抽樣規(guī)范
3術(shù)語和定義
本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。
4原理
試樣中殘留的甲苯咪唑及其代謝物。用乙酸乙酯提取，正己烷除酯，陽離子固相萃取柱凈化，高效液相色譜-紫外檢測器測定，外標(biāo)法定量。
5試劑和材料
以下所用試劑，除另有注明外均為分析純、水為符合gb/t 6682規(guī)定的一級(jí)水。
5.1試劑
5.1.1乙腈（ch3cn）：色譜純。
5.1.2甲醇（ch3oh）：色譜純。
5.1.3正己烷（c6h14）：色譜純。
5.1.4乙酸乙酯（ch3cooch2ch3）：色譜純。
5.1.5 n，n-二甲基甲酰胺（c3 h7no）：色譜純。
5.1.6磷酸（h3po4）。
5.1.7磷酸二氫銨（nh4h2po4）。
5.1.8三乙胺[（c2h5）3n]。
5.1.9甲酸（hcooh）。
5.1.10氨水（nh3·h2o）。
5.2標(biāo)準(zhǔn)品
甲苯咪唑（mebendazole，c16h13n3o3，cas號(hào)：31431-39-7）、羥基甲苯咪唑（5 -hydroxymebendazole，c16h15n3o3，cas號(hào)：60254-95-7）和氨基甲苯咪唑（amino mebendazole，c14h11n3o，cas號(hào)：52329-60-9）：含量≥98%。
5.3溶液配制
5.3.1 80%甲醇溶液：取甲醇80 ml，加水至100 ml，混勻。
5.3.2 1%甲酸溶液：取甲酸1 ml，加水至100 ml，混勻。
5.3.3 0.05 mol/l磷酸二氫銨-三乙胺溶液：取磷酸二氫銨5.8 g，加水溶解并稀釋至1000 ml，加三乙胺1 ml，混勻。
5.3.4 0.05mol/l磷酸二氫銨緩沖液：取磷酸二氫銨2.9g，加水450ml使溶解，用磷酸調(diào)ph至2.0，用水稀釋至500 ml。
5.3.5 5%氨化甲醇溶液：取氨水5 ml、甲醇95 ml，混勻；臨用前配制。
5.3.6溶解液：取n，n-二甲基甲酰胺150ml，用0.05mol/l磷酸二氫銨緩沖液稀釋至500ml。
5.4標(biāo)準(zhǔn)溶液制備
5.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100μg/ml）：分別取甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑和羥基甲苯咪唑各10 mg，精密稱定，加甲酸5ml使其溶解，并用甲醇稀釋定容至100ml容量瓶，搖勻，配制成濃度各為10μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。-18℃以下避光保存，有效期6個(gè)月。
5.4.2混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別準(zhǔn)確量取甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑和羥基甲苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋配制成含氨基甲苯咪唑5μg/ml、羥基甲苯咪唑2.5μg/ml和甲苯咪唑2.5μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。-18℃以下避光保存，有效期3個(gè)月。
5.5材料
5.5.1混合型陽離子固相萃取柱：60 mg/3 ml，或相當(dāng)者。
5.5.2水相聚砜醚針式濾器：0.45μm。
6儀器和設(shè)備
6.1高效液相色譜儀，配紫外檢測器。
6.2分析天平：感量0.00001 g和0.01 g。
6.3離心機(jī)：6 000 r/min。
6.4旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。
6.5固相萃取裝置。
6.6超聲波清洗儀。
6.7氮吹儀。
6.8雞心瓶：100 ml。
7試樣的制備與保存
7.1試樣的制備
按gb/t 30891-2014中附錄b的要求制樣。
a）取均質(zhì)后的供試樣品，作為供試試樣；
b）取均質(zhì)后的空白樣品，作為空白試樣；
c）取均質(zhì)后的空白樣品，添加適宜濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為空白添加試樣。
7.2試樣的保存
-18℃以下保存，有效期3個(gè)月。
8測定步驟
8.1提取
取試樣3 g（準(zhǔn)確至±0.03 g）于50 ml離心管中，加水2 ml，渦旋30 s，使其分散；加乙酸乙酯10 ml，振蕩2 min，超聲5 min，4 500 r/min離心10 min，乙酸乙酯轉(zhuǎn)入100 ml雞心瓶。殘?jiān)右宜嵋阴?0 ml，按上述方法重復(fù)提取2次。合并乙酸乙酯至100 ml雞心瓶中，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。加80%甲醇溶液3 ml，渦旋混合1 min，加正己烷3 ml，混合1 min，將溶液轉(zhuǎn)入10 ml離心管中，6000 r/min離心5 min，去除正己烷層；下層再加正己烷3 ml，重復(fù)去脂一次。向下層溶液中加1%甲酸水溶液3 ml，混勻，6 000 r/min離心5 min，上清液備用。
8.2凈化
固相萃取柱依次用甲醇、水各3 ml活化，將上清液過柱；依次用水、甲醇各4 ml淋洗，棄去流出液，抽干。用5%氨化甲醇溶液5 ml洗脫，洗脫液接收至10 ml離心管中，40℃氮?dú)獯蹈伞＜尤芙庖?.0ml溶解殘余物，渦旋混合1min，用水相針式濾器過濾至進(jìn)樣小瓶中，供高效液相色譜測定。
8.3標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備
精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液適量，用溶解液稀釋配制成甲苯咪唑、羥基甲苯咪唑濃度分別為0.02μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml和1.0μg/ml，氨基甲苯咪唑濃度為0. 04μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml和2μg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，供高效液相色譜測定。分別以甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑和羥基甲苯咪唑的峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。此標(biāo)準(zhǔn)工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。
8.4測定
8.4.1液相色譜條件
a）色譜柱：c18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），或相當(dāng)者；
b）流動(dòng)相：a為乙腈，b為0. 05 mol/l磷酸二氫銨三乙胺溶液，梯度洗脫條件見表1；
c）流速：0.9 ml/min；
d）柱溫：40℃；
e）進(jìn)樣量：30μl；
f）檢測波長：289 nm。
8.4.2測定法
取系列標(biāo)準(zhǔn)工作液和試樣溶液，作單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)，按外標(biāo)法以色譜峰面積定量。標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣液中甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑和羥基甲苯咪唑的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。在上述色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖見附錄a。
8.5空白試驗(yàn)
取空白試料，除不加標(biāo)準(zhǔn)溶液外，采用相同的測定步驟進(jìn)行平行操作。
9結(jié)果計(jì)算和表述
試樣中甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑和羥基甲苯咪唑的殘留量按公式（1）計(jì)算。
式中：
x——試樣中甲苯咪唑或代謝物殘留量的數(shù)值，單位為微克每千克（μg/kg）；
ci——從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算得到的試樣溶液中甲苯咪唑或代謝物濃度的數(shù)值，單位為微克每毫升（μg/ml）；
v——溶解殘余物體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
f——稀釋倍數(shù)；
1 000——換算系數(shù)；
m——供試試樣質(zhì)量的數(shù)值，單位為克（g）。
10方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度
10.1靈敏度
本方法甲苯咪唑和羥基甲苯咪唑檢測限為5μg/kg，定量限為10μg/kg。
本方法氨基甲苯咪唑檢測限為10μg/kg；
10.2準(zhǔn)確度
本方法甲苯咪唑，羥基甲苯咪唑在10μg/kg~200μg/kg，氨基用苯味唑在20μg/kg~400μg/kg的添加濃度范圍內(nèi)，回收率為70%~100%。
10.3精密度
本方法批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15%。