rtca技術(shù)與mtt對比
rtca技術(shù)簡介：
原理：實時無標(biāo)記動態(tài)細(xì)胞分析技術(shù)（rtca，real time cellular analysis）是通過特殊工藝，將微電子細(xì)胞傳感器芯片整合到細(xì)胞檢測板的底部，用以構(gòu)建實時、動態(tài)、定量跟蹤細(xì)胞形態(tài)和增殖分化等改變的細(xì)胞阻抗檢測傳感系統(tǒng)。當(dāng)貼壁生長在微電極表面的細(xì)胞引起貼壁電極界面阻抗的改變時，這種改變與細(xì)胞的實時功能狀態(tài)改變呈相關(guān)性，通過實時動態(tài)的電極阻抗檢測可以獲得細(xì)胞生理功能相關(guān)的生物信息，包括細(xì)胞生長、伸展、形態(tài)變化、死亡和貼壁等。
rtca技術(shù)細(xì)胞增殖及毒性檢測實驗步驟：
1、向e-plate檢測板中加入培養(yǎng)基并測定背景阻抗值。
2、收集對數(shù)期細(xì)胞并計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，向e-plate檢測板中加入一定體積的細(xì)胞，室溫超凈臺內(nèi)放置30min。
3、將加入細(xì)胞的e-plate檢測板放入檢測臺上（檢測臺預(yù)先放入培養(yǎng)箱中），進行實時動態(tài)的細(xì)胞增殖檢測。
4、過夜檢測后，向各培養(yǎng)孔中加入配制好的梯度藥物并繼續(xù)進行實時動態(tài)檢測， 即可獲得化合物介導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)曲線及不同時間段ic50值。
rtca實時無標(biāo)記技術(shù)細(xì)胞增殖及毒性檢測實驗流程：
特點：
1、實驗操作簡單，步驟少，人為誤差小。
2、采用無標(biāo)記方法，不存在標(biāo)記效率問題，并且對細(xì)胞無損傷，細(xì)胞在生理狀態(tài)下進行檢測，結(jié)果準(zhǔn)確度高。
3、實驗結(jié)果客觀，重復(fù)性好，不需設(shè)置重復(fù)孔（實驗操作需規(guī)范，如有特殊要求也可設(shè)置重復(fù)孔）。
4、因預(yù)先對基礎(chǔ)阻抗值測定，所以無需設(shè)置空白對照孔。
5、完整細(xì)胞效應(yīng)圖譜，提供大量、重要的動態(tài)反應(yīng)信息。
典型的利用rtca技術(shù)獲得的細(xì)胞增殖實驗檢測結(jié)果：
接種不同密度的a549細(xì)胞獲得的細(xì)胞增殖實時動態(tài)曲線
利用rtca技術(shù)獲得的典型的細(xì)胞毒性實驗檢測結(jié)果：
taxol引起的濃度依賴性作用曲線及軟件自動生成的ic50值
mtt法簡介：
原理：mtt法又稱mtt比色法，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性mtt還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（dmso）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。
mtt實驗步驟：
1、收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul，鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000個/孔，（邊緣孔用無菌pbs填充）。
2、5%co2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）。
3、加入濃度梯度的藥物，原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般5-7個梯度，每孔100ul，設(shè)3-5個復(fù)孔.建議設(shè)5個，否則難以反應(yīng)真實情況。
4、5% co2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
5、每孔加入20ul mtt溶液（5mg/ml，即0.5%mtt），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與mtt能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用pbs沖2-3遍后，再加入含mtt的培養(yǎng)液。
6、終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。
7、每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀od490nm處測量各孔的吸光值。
8、同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、mtt、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、mtt、二甲基亞砜）。
mtt檢測結(jié)果：
mtt法細(xì)胞增殖實驗檢測結(jié)果 典型的mtt法細(xì)胞毒性實驗檢測結(jié)果
rtca技術(shù)與mtt優(yōu)勢對比：
rtca技術(shù)
mtt
標(biāo)記物
無，對細(xì)胞無傷害
有，對細(xì)胞有傷害
實驗數(shù)據(jù)
連續(xù)的實時動態(tài)曲線
終點檢測（單點數(shù)據(jù)）
實驗步驟
簡單
繁瑣
實驗重復(fù)性
高
低
實驗數(shù)據(jù)獲取
自動
手動
細(xì)胞活性信息
粘附、活力、形態(tài)
活力
時間量效檢測
一次，同時獲取
多次實驗
數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性
高
低
實驗耗時
短
長
檢測過程
培養(yǎng)箱內(nèi)進行（正常生長環(huán)境）
培養(yǎng)箱外（非細(xì)胞生長環(huán)境）
實驗后的細(xì)胞樣品
可用于其他細(xì)胞檢測實驗
只能丟棄
預(yù)測細(xì)胞毒性作用機制
可以
不能
動態(tài)ic50值
可以
不能
實驗結(jié)果實例