qrt-pcr常常被用來(lái)對(duì)rna-seq或芯片測(cè)序得到的有意義的基因表達(dá)情況進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析，本文主要從qrt-pcr的原理、定量方法等方面進(jìn)行講解。
區(qū)別
熒光定量pcr
常規(guī)pcr
檢測(cè)時(shí)間
實(shí)時(shí)+終點(diǎn)
終點(diǎn)
檢測(cè)信號(hào)
熒光染料或者探針
核酸染料
準(zhǔn)確度
定量
半定量
是否能檢測(cè)終點(diǎn)產(chǎn)物
能
能
是否能計(jì)算起始濃度
能
否
儀器要求
熒光定量pcr儀
常規(guī)pcr儀
一、qrt-pcr定量原理
qrt-pcr，即實(shí)時(shí)熒光定量pcr，就是通過(guò)對(duì)pcr擴(kuò)增反應(yīng)每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量分析。因?yàn)樵趐cr擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的ct 值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以可以定量。（ct 值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù) (cycle)，ct 值越小，反應(yīng)擴(kuò)增到達(dá)平臺(tái)期所需循環(huán)數(shù)越少，目的基因起始含量越高）。
qpcr的熒光標(biāo)記方法分為以sybr green i染料法為主的熒光染料嵌合法，以taqman探針?lè)橹鞯臒晒馓结樂(lè)ǎ╟ycling probe，molecular bracon等），淬滅染料引物法。
①sybr green i染料法
sybr green i 是高靈敏度的非特異性雙鏈dna熒光染料，具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)。它以非特異性方式結(jié)合在dsdna雙螺旋小溝區(qū)域。游離的sybr green i 只發(fā)出微弱的熒光信號(hào)，pcr過(guò)程中，當(dāng)擴(kuò)增生成dsdna時(shí)，sybr green i 逐漸與dsdna結(jié)合，熒光信號(hào)被千倍放大，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與擴(kuò)增得到的dsdna的濃度成正比。熒光信號(hào)被儀器檢測(cè)并采集得到“擴(kuò)增曲線”，通過(guò)熒光信號(hào)的強(qiáng)度反映出體系中dsdna的濃度。
但sybr green i 與特異性擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合時(shí)還可以同引物二聚體、非特異性擴(kuò)增的dsdna結(jié)合，影響結(jié)果判斷。所以擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，還必須對(duì)生成的dsdna進(jìn)行分析：即通過(guò)升溫，dsdna雙鏈解開(kāi)，sybr green i 染料脫落，熒光值逐漸下降，形成溫度和熒光強(qiáng)度的曲線即“熔解曲線（melting curve）”，由此判斷體系中是否存在引物二聚體、非特異性擴(kuò)增。
sybr green i 染料法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、成本較低，被廣泛地應(yīng)用于dna及rna定量、 基因表達(dá)量的研究、轉(zhuǎn)基因重組動(dòng)植物的研究等。
②taqman探針?lè)?br>taqman探針是由5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)和3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)以及與目標(biāo)基因特異性結(jié)合的寡核苷酸序列組成。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，此時(shí)儀器不會(huì)檢測(cè)到熒光信號(hào)。在pcr擴(kuò)增時(shí)，模板dna變性解鏈，taqman探針特異性結(jié)合到目標(biāo)基因處，而taq酶具有5’-3’核酸外切酶活性，延伸至探針結(jié)合處，可將探針?biāo)?，使熒光?bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，從而檢測(cè)到熒光信號(hào)，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與擴(kuò)增得到的dsdna的濃度成正比。熒光信號(hào)被儀器檢測(cè)并采集得到“擴(kuò)增曲線”，通過(guò)熒光信號(hào)的強(qiáng)度反映出體系中dsdna的濃度。
taqman探針?lè)ㄒ蚱涮禺愋愿撸粡V泛地應(yīng)用于等位基因鑒別、snp分型、病原體和病毒檢測(cè)、疾病耐藥基因研究、多重定量等。