中華人民共和國國家標準
gb 5009.83-2016
食品安全國家標準食品中胡蘿卜素的測定
前言
本標準代替gb 5413.35-2010《食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中β-胡蘿卜素的測定》、gb/t 5009.83-2003《食品中胡蘿卜素的測定》和ny/t 82.15-1988《果汁測定方法β-胡蘿卜素的測定》。
本標準與gb5413.35—2010相比，主要變化如下：
——標準名稱修改為“食品安全國家標準食品中胡蘿卜素的測定”；
——增加了普通食品的前處理方法；
——增加了需要區(qū)分α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素的色譜條件；
——修改了胡蘿卜素的結(jié)果表達。
1范圍
本標準規(guī)定了食品中胡蘿卜素的測定方法。
本標準色譜條件一適用于食品中α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素及總胡蘿卜素的測定，色譜條件二適用于食品中β-胡蘿卜素的測定。
2原理
試樣經(jīng)皂化使胡蘿卜素釋放為游離態(tài)，用石油醚萃取二氯甲烷定容后，采用反相色譜法分離，外標法定量。
3試劑和材料
除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為gb/t 6682規(guī)定的一級水。
3.1試劑
3.1.1α-淀粉酶：酶活力≥1.5u/mg。
3.1.2木瓜蛋白酶：酶活力≥5u/mg。
3.1.3氫氧化鉀(koh)。
3.1.4無水硫酸鈉(na2so4)。
3.1.5抗壞血酸(c6h8o6)。
3.1.6石油醚：沸程30℃~60℃。
3.1.7甲醇(ch4o)：色譜純。
3.1.8乙腈(c2h3n)：色譜純。
3.1.9三氯甲烷(chcl3)：色譜純。
3.1.10甲基叔丁基醚[ch3oc(ch3)3]：色譜純。
3.1.11二氯甲烷(ch2cl2)：色譜純。
3.1.12無水乙醇(c2h6o)：優(yōu)級純。
3.1.13正己烷(c6h14)：色譜純。
3.1.14 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(c15h24o，bht)。
3.2試劑配制
氫氧化鉀溶液：稱固體氫氧化鉀500g，加入500ml水溶解。臨用前配制。
3.3標準品
3.3.1α-胡蘿卜素(c40h56，cas號：7488-99-5)：純度≥95%，或經(jīng)國家認證并授予標準物質(zhì)證書的標準物質(zhì)。
3.3.2β-胡蘿卜素(c40h56，cas號：7235-40-7)：純度≥95%，或經(jīng)國家認證并授予標準物質(zhì)證書的標準物質(zhì)。
3.4標準溶液配制
3.4.1α-胡蘿卜素標準儲備液(500μg/ml)：準確稱取α-胡蘿卜素標準品50mg(精確到0.1mg)，加入0.25gbht，用二氯甲烷溶解，轉(zhuǎn)移至100ml棕色容量瓶中定容至刻度。于-20℃以下避光儲存，使用期限不超過3個月。標準儲備液用前需進行標定，具體操作見附錄a。
3.4.2α-胡蘿卜素標準中間液(100μg/ml)：由α-胡蘿卜素標準儲備液中準確移取10.0ml溶液于50ml棕色容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度。
3.4.3β-胡蘿卜素標準儲備液(500μg/ml)：準確稱取β-胡蘿卜素標準品50mg(精確到0.1mg)，加入0.25gbht，用二氯甲烷溶解，轉(zhuǎn)移至100ml棕色容量瓶中定容至刻度。于-20℃以下避光儲存，使用期限不超過3個月。標準儲備液用前需進行標定，具體操作見附錄a。
注：β-胡蘿卜素標準品主要為全反式(all-e)β-胡蘿卜素，在儲存過程中受到溫度、氧化等因素的影響，會出現(xiàn)部分全反式β-胡蘿卜素異構(gòu)化為順式β-胡蘿卜素的現(xiàn)象，如9-順式(9z)-β-胡蘿卜素、13-順式(13z)-β-胡蘿卜素、15-順式(15z)-β-胡蘿卜素等。如果采用色譜條件一進行β-胡蘿卜素的測定，應按照附錄b確認β-胡蘿卜素異構(gòu)體保留時間，并計算全反式β-胡蘿卜素標準溶液色譜純度。
3.4.4β-胡蘿卜素標準中間液(100μg/ml)：從β-胡蘿卜素標準儲備液中準確移取10.0ml溶液于50ml棕色容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度。
3.4.5α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素混合標準工作液(色譜條件一用)：準確移取α-胡蘿卜素標準中間液0.50ml、1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml、10.00ml溶液至6個100ml棕色容量瓶，分別加入3.00mlβ-胡蘿卜素中間液，用二氯甲烷定容至刻度，得到α-胡蘿卜素濃度分別為0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、3.0μg/ml、4.0μg/ml、10.00μg/ml，β-胡蘿卜素濃度均為3.0μg/ml的系列混合標準工作液。
3.4.6β-胡蘿卜素標準工作液(色譜條件二用)：從β-胡蘿卜素標準中間液中分別準確移取0.50ml、1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml、10.00ml溶液至6個100ml棕色容量瓶。用二氯甲烷定容至刻度，得到濃度為0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、3.0μg/ml、4.0μg/ml、10μg/ml的系列標準工作液。
4儀器和設備
4.1勻漿機。
4.2高速粉碎機。
4.3恒溫振蕩水浴箱：控溫精度±1℃。
4.4旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。
4.5氮吹儀。
4.6紫外-可見光分光光度計。
4.7高效液相色譜儀(hplc儀)：帶紫外檢測器。
5分析步驟
注：整個實驗操作過程應注意避光。
5.1試樣制備
谷物、豆類、堅果等試樣需粉碎、研磨、過篩(篩板孔徑0.3mm~0.5mm)；蔬菜、水果、蛋、藻類等試樣用勻質(zhì)器混勻；固體粉末狀試樣和液體試樣用前振搖或攪拌混勻。4℃冰箱可保存1周。
5.2試樣處理
5.2.1普通食品試樣
5.2.1.1預處理
蔬菜、水果、菌藻類、谷物、豆類、蛋類等普通食品試樣準確稱取混合均勻的試樣1g~5g(精確至0.001g)，油類準確稱取0.2g~2g(精確至0.001g)，轉(zhuǎn)至250ml錐形瓶中，加入1g抗壞血酸、75ml無水乙醇，于60℃±1℃水浴振蕩30min。
如果試樣中蛋白質(zhì)、淀粉含量較高(>10%)，先加入1g抗壞血酸、15ml45℃~50℃溫水、0.5g木瓜蛋白酶和0.5gα-淀粉酶，蓋上瓶塞混勻后，置55℃±1℃恒溫水浴箱內(nèi)振蕩或超聲處理30min后，再加入75ml無水乙醇，于60℃±1℃水浴振蕩30min。
5.2.1.2皂化
加入25ml氫氧化鉀溶液，蓋上瓶塞。置于已預熱至53℃±2℃恒溫振蕩水浴箱中，皂化30min。取出，靜置，冷卻到室溫。
5.2.2添加β-胡蘿卜素的食品試樣
5.2.2.1預處理
固體試樣：準確稱取1g~5g(精確至0.001g)，置于250ml錐形瓶中，加入1g抗壞血酸，加50ml45℃~50℃溫水混勻。加入0.5g木瓜蛋白酶和0.5gα-淀粉酶(無淀粉試樣可以不加α-淀粉酶)，蓋上瓶塞，置55℃±1℃恒溫水浴箱內(nèi)振蕩或超聲處理30min。
液體試樣：準確稱取5g~10g(精確至0.001g)，置于250ml錐形瓶中，加入1g抗壞血酸。
5.2.2.2皂化
取預處理后試樣，加入75ml無水乙醇，搖勻，再加入25ml氫氧化鉀溶液，蓋上瓶塞。置于已預熱至53℃±2℃恒溫振蕩水浴箱中，皂化30min。取出，靜置，冷卻到室溫。
注：如皂化不完全可適當延長皂化時間至1h。
5.3試樣萃取
將皂化液轉(zhuǎn)入500ml分液漏斗中，加入100ml石油醚，輕輕搖動，排氣，蓋好瓶塞，室溫下振蕩10min后靜置分層，將水相轉(zhuǎn)入另一分液漏斗中按上述方法進行第二次提取。合并有機相，用水洗至近中性。棄水相，有機相通過無水硫酸鈉過濾脫水。濾液收入500 ml蒸發(fā)瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上40℃±2℃減壓濃縮，近干。用氮氣吹干，用移液管準確加入5.0ml二氯甲烷，蓋上瓶塞，充分溶解提取物。經(jīng)0.45μm膜過濾后，棄出初始約1ml濾液后收集至進樣瓶中，備用。
注：必要時可根據(jù)待測樣液中胡蘿卜素含量水平進行濃縮或稀釋，使待測樣液中α-胡蘿卜素和/或β-胡蘿卜素濃度在0.5μg/ml~10μg/ml范圍內(nèi)。
5.4色譜測定
5.4.1色譜條件一(適用于食品中α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素及總胡蘿卜素的測定)
5.4.1.1參考色譜條件
參考色譜條件列出如下：
a)色譜柱：c30柱，柱長150mm，內(nèi)徑4.6mm，粒徑5μm，或等效柱；
b)流動相：a相：甲醇∶乙腈∶水=73.5∶24.5∶2；
b相：甲基叔丁基醚；
c)流速：1.0ml/min；
d)檢測波長：450nm；
e)柱溫：30℃±1℃；
f)進樣體積：20μl。
5.4.1.2繪制α-胡蘿卜素標準曲線、計算全反式β-胡蘿卜素響應因子
將α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素混合標準工作液注入hplc儀中(色譜圖見圖c.1)，根據(jù)保留時間定性，測定α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素各異構(gòu)體峰面積。
α-胡蘿卜素根據(jù)系列標準工作液濃度及峰面積，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程。
β-胡蘿卜素根據(jù)標準工作液標定濃度、全反式β-胡蘿卜素6次測定峰面積平均值、全反式β-胡蘿卜素色譜純度(cp，計算方法見附錄b)，按式(1)計算全反式β-胡蘿卜素響應因子。
式中：
rf——全反式β-胡蘿卜素響應因子，單位為峰面積毫升每微克(au·ml/μg)；
`aall-e——全反式β-胡蘿卜素標準工作液色譜峰峰面積平均值，單位為峰面積(au)；
ρ——β-胡蘿卜素標準工作液標定濃度，單位為微克每毫升(μg/ml)；
cp——全反式β-胡蘿卜素的色譜純度，%。
5.4.1.3試樣測定
在相同色譜條件下，將待測液注入液相色譜儀中，以保留時間定性，根據(jù)峰面積采用外標法定量。α-胡蘿卜素根據(jù)標準曲線回歸方程計算待測液中α-胡蘿卜素濃度，β-胡蘿卜素根據(jù)全反式β-胡蘿卜素響應因子進行計算。
5.4.2色譜條件二(適用食品中β-胡蘿卜素的測定)
5.4.2.1參考色譜條件
參考色譜條件列出如下：
a)色譜柱：c18柱，柱長250mm，內(nèi)徑4.6mm，粒徑5μm，或等效柱；
b)流動相：三氯甲烷∶乙腈∶甲醇=3∶12∶85，含抗壞血酸0.4g/l，經(jīng)0.45μm膜過濾后備用；
c)流速：2.0ml/min；
d)檢測波長：450nm；
e)柱溫：35℃±1℃；
f)進樣體積：20μl。
5.4.2.2標準曲線的制作
將β-胡蘿卜素標準工作液注入hplc儀中(色譜圖見圖c.2)，以保留時間定性，測定峰面積。以標準系列工作液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程。
5.4.2.3試樣測定
在相同色譜條件下，將待測試樣液分別注入液相色譜儀中，進行hplc分析，以保留時間定性，根據(jù)峰面積外標法定量，根據(jù)標準曲線回歸方程計算待測液中β-胡蘿卜素的濃度。
注：本色譜條件適用于α-胡蘿卜素含量較低(小于總胡蘿卜素10%)的食品試樣中β-胡蘿卜素的測定。
6分析結(jié)果的表述
6.1色譜條件一
試樣中α-胡蘿卜素含量按式(2)計算：
式中：
xα——試樣中α-胡蘿卜素的含量，單位為微克每百克(μg/100g)；
ρα——從標準曲線得到的待測液中α-胡蘿卜素濃度，單位為微克每毫升(μg/ml)；
v——試樣液定容體積，單位為毫升(ml)；
100——將結(jié)果表示為微克每百克(μg/100g)的系數(shù)；
m——試樣質(zhì)量，單位為克(g)。
試樣中β-胡蘿卜素含量按式(3)計算：
式中：
xβ——試樣中β-胡蘿卜素的含量，單位為微克每百克(μg/100g)；
aall-e——試樣待測液中全反式β-胡蘿卜素峰面積，單位為峰面積(au)；
a9z——試樣待測液中9-順式-β-胡蘿卜素的峰面積，單位為峰面積(au)；
a13z——試樣待測液中13-順式-β-胡蘿卜素的峰面積，單位為峰面積(au)；
1.2——13-順式-β-胡蘿卜素的相對校正因子；
a15z——試樣待測液中15-順式-β-胡蘿卜素的峰面積，單位為峰面積(au)；
1.4——15-順式-β-胡蘿卜素的相對校正因子；
axz——試樣待測液中其他順式β-胡蘿卜素的峰面積，單位為峰面積(au)；
v——試樣液定容體積，單位為毫升(ml)；
100——將結(jié)果表示為微克每百克(μg/100g)的系數(shù)；
rf——全反式β-胡蘿卜素響應因子，單位為峰面積毫升每微克(au·ml/μg)；
m——試樣質(zhì)量，單位為克(g)。
注1：由于β-胡蘿卜素各異構(gòu)體百分吸光系數(shù)不同(見附錄d)，所以在β-胡蘿卜素計算過程中，需采用相對校正因子對結(jié)果進行校正。
注2：如果試樣中其他順式β-胡蘿卜素含量較低，可不進行計算。
試樣中總胡蘿卜素含量按式(4)計算：
式中：
x總——試樣中總胡蘿卜素的含量，單位為微克每百克(μg/100g)；
xα——試樣中α-胡蘿卜素的含量，單位為微克每百克(μg/100g)；
xβ——試樣中β-胡蘿卜素的含量，單位為微克每百克(μg/100g)。
注：必要時，α-胡蘿卜素，β-胡蘿卜素可轉(zhuǎn)化為微克視黃醇當量(μgre)進行表示。
計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
6.2色譜條件二
試樣中β-胡蘿卜素含量按式(5)計算：
式中：
xβ——試樣中β-胡蘿卜素的含量，單位為微克每百克(μg/100g)；
ρβ——從標準曲線得到的待測液中β-胡蘿卜素濃度，單位為微克每毫升(μg/ml)；
v——試樣液定容體積，單位為毫升(ml)；
100——將結(jié)果表示為微克每百克(μg/100g)的系數(shù)；
m——試樣質(zhì)量，單位為克(g)。
注：結(jié)果中包含全反式β-胡蘿卜素、9-順式-β-胡蘿卜素、13-順式-β-胡蘿卜素、15-順式-β-胡蘿卜素、其他順式異構(gòu)體；不排除可能有部分α-胡蘿卜素。
計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
7精密度
在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。
8其他
試樣稱樣量為5g時，α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素檢出限均為0.5μg/100g，定量限均為1.5μg/100g。