簡介
在室溫下分子大都處在基態(tài)的zui低振動能級，當(dāng)受到光的照射時，便吸收與它的特征頻率相一致的光線，其中某些電子由原來的基態(tài)能級躍遷到*電子激發(fā)態(tài)或更高電子激發(fā)態(tài)中的各個不同振動能級，這就是在分光光度法中所述的吸光現(xiàn)象。躍遷到較高能級的分子，很快通過振動弛豫、內(nèi)轉(zhuǎn)換等方式釋放能量后下降到*電子激發(fā)態(tài)的zui低振動能級，能量的這種轉(zhuǎn)移形式，稱為*躍遷。再由*電子激發(fā)態(tài)的zui低振動能級下降到基態(tài)的任何振動能級，并以光的形式放出它們所吸收的能量，這種光便稱為熒光。
圖1.熒光機(jī)理（jablonski圖）熒光分析法是測定物質(zhì)吸收了一定頻率的光以后，物質(zhì)本身所發(fā)射的光的強(qiáng)度。物質(zhì)吸收的光，稱為激發(fā)光。物質(zhì)所發(fā)射的光，稱為發(fā)射光或熒光。如果將激發(fā)光用單色器分光后，連續(xù)測定相應(yīng)的熒光強(qiáng)度所得到的光譜，被稱為該熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。選取激發(fā)光譜中zui大吸收峰處的波長，固定波長檢測物質(zhì)所發(fā)射的熒光的波長和強(qiáng)度，所得到的曲線稱為該物質(zhì)的熒光發(fā)射光譜。激發(fā)和發(fā)射光譜是熒光物質(zhì)定性的依據(jù)。對于某一熒光物質(zhì)的稀溶液，在一定波長和一定強(qiáng)度的入射光照射下，當(dāng)液層的厚度不變時，所發(fā)生的熒光強(qiáng)度和該溶液的濃度成正比，這是熒光定量分析的基礎(chǔ)。為獲得*數(shù)據(jù)，儀器參數(shù)的設(shè)定尤其重要。在本技術(shù)指南中，對lumina儀器參數(shù)的含義進(jìn)行說明，同時說明設(shè)定值變更和熒光光譜變化之間的相關(guān)性。
儀器參數(shù)
pmt：光電倍增管電壓，可增加熒光強(qiáng)度。pmt的設(shè)定值越高，熒光強(qiáng)度就越高，不過噪聲信號也會增加；因此，可根據(jù)樣品適當(dāng)調(diào)整。狹縫：可調(diào)整光束寬度，光束寬度越寬，到達(dá)樣品的光束越多，熒光強(qiáng)度也會增加。發(fā)射波長間隔：檢測樣品時，可設(shè)定波長間隔。如設(shè)定為0.1nm，光束的照射密度會很密，會使檢測時間變長。積分時間：檢測樣品時按照波長間隔向樣品照射光束的時間。假設(shè)在400～600nm范圍內(nèi)進(jìn)行發(fā)射掃描，積分時間為20ms，如將間隔設(shè)為0.1nm，熒光檢測步驟如下：400nm波長下，照射20ms；400.1nm波長下，照射20ms；400.2nm波長下，照射20ms。也就是說，隨著積分時間的增加，在各波長下照射光束的時間也會增加，使得掃描速率 (nm/min)變慢，熒光強(qiáng)度增加。
標(biāo)準(zhǔn)樣品：
•熒光素(3×10-6m)
上述參數(shù)可根據(jù)樣品進(jìn)行調(diào)整。
圖 2.熒光素的分子結(jié)構(gòu)
•蒽(1×10-5m)
圖 2.熒光素的分子結(jié)構(gòu)
2.lumina熒光分光計(jì)
3.luminous軟件
4.熒光比色皿（光程10 mm）
實(shí)驗(yàn)步驟
按照*的儀表參數(shù)對標(biāo)準(zhǔn)樣品（熒光素、蒽）進(jìn)行檢測后，邊更改儀表參數(shù)設(shè)定，邊確認(rèn)熒光光譜的變化。
1.檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的激發(fā)、發(fā)射光譜
2.檢測不同pmt值下的發(fā)射光譜熒光強(qiáng)度變化
3.檢測不同狹縫值下的發(fā)射光譜熒光強(qiáng)度變化
4.檢測不同積分時間值下的發(fā)射光譜熒光強(qiáng)度和掃描速率變化
5.檢測不同發(fā)射波長間隔對掃描速率和熒光光譜的影響
6.檢測不同掃描速率對光譜的影響
7.檢測不同響應(yīng)時間對光譜的影響
結(jié)果
1.標(biāo)準(zhǔn)樣品的激發(fā)、發(fā)射光譜
圖4為按照圖5所示儀表參數(shù)進(jìn)行檢測的熒光素激發(fā)、發(fā)射光譜。
圖 4.熒光素 3×10-6m的激發(fā)光譜（紅色）和發(fā)射光譜（黑色）
圖 5.儀器參數(shù)設(shè)置
2.不同pmt 值對發(fā)射光譜的影響
如圖6所示，隨著熒光素pmt電壓的增加，熒光強(qiáng)度會增加。
圖7為不同狹縫寬度下熒光強(qiáng)度的變化。通過狹縫寬度的變更，可調(diào)整激發(fā)光和放射光的量。通過實(shí)驗(yàn)可以看出變更狹縫寬度對熒光強(qiáng)度的影響大于變更pmt值對熒光強(qiáng)度的影響。e=宋體 >電壓的增加，熒光強(qiáng)度會增加。
圖 7.不同狹縫寬度對熒光強(qiáng)度的影響
4.不同積分時間對發(fā)射光譜及掃描速度的影響增加積分時間，即增加光束照射樣品的時間，發(fā)射光強(qiáng)度會增加，還可確認(rèn)熒光掃描速率也會發(fā)生變化。
圖 8.不同積分時間下的熒光強(qiáng)度及掃描速率值的變化
5.不同發(fā)射波長間隔下發(fā)射光譜的變化lumina的熒光光譜掃描速度設(shè)置為用戶自定義時，積分時間、平均數(shù)、掃描間隔可以按照自己的意愿進(jìn)行設(shè)定。增加發(fā)射波長間隔時，檢測間隔會增加，故掃描速率會加快。當(dāng)掃描速率加快時，如圖9所示，光譜 fwhm變寬。
圖9.不同發(fā)射波長間隔時對熒光強(qiáng)度及掃描速率值影響
6.不同掃描速率對發(fā)射光譜的影響其他參數(shù)不變的情況下，隨著掃描速率的加快，光譜fwhm變寬。
總結(jié)
儀表參數(shù)的設(shè)定會對光譜數(shù)據(jù)產(chǎn)生巨大的影響。根據(jù)樣品類型、濃度及純度，儀表參數(shù)的設(shè)定值應(yīng)會有所不同，檢測員需根據(jù)樣品類型和狀態(tài)，變更儀表參數(shù)的設(shè)定值，以求獲得*的光譜條件。erun:'yes';font-family:'times new roman'; >其他參數(shù)不變的情況下，隨著掃描速率的加快，光譜fwhm變寬。