高品質(zhì)的游離dna (cell free dna) ngs文庫構(gòu)建
thruplex®plasma-seq ki
· 專為cfdna設(shè)計(jì)：經(jīng)過優(yōu)化的修復(fù)及連接試劑
· 高品質(zhì)ngs文庫：高的文庫多樣性，在寬廣的gc含量范圍內(nèi)，可以達(dá)到高檢測再現(xiàn)性
· 起始量范圍廣：＜1 ng到30 ng cfdna量
· 快速簡便：1個反應(yīng)管、2小時、3步反應(yīng)的簡單操作，無需純化或樣品轉(zhuǎn)移步驟
· 應(yīng)用領(lǐng)域：液態(tài)活檢、ctdna、目標(biāo)區(qū)域測序等領(lǐng)域文庫構(gòu)建
· 兼容自動化平臺：beckman fxp workstation
■ 產(chǎn)品說明：
thruplex plasma-seq kit基于thruplex技術(shù)，并用于血漿來源cfdna高品質(zhì)ngs文庫構(gòu)建。該試劑已針對cfdna進(jìn)行了專門優(yōu)化，在保持樣本gc代表性的基礎(chǔ)上，盡可能的提升了文庫的復(fù)雜度。文庫可用于cnv分析、全基因組測序分析或是采用一些panel針對目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行捕獲富集后的dna分析,如agilent sureselect and roche nimblegen seqcap ez。
thruplex plasma-seq kit不包含index。兼容的 index如下所述，需要單獨(dú)購買。
使用 thruplex plasma-seq試劑盒制備的文庫，提供了更高的靈敏度，可以更好地了解血漿樣本中基因變異結(jié)果。與其它液態(tài)活檢的樣品一樣，血漿由于其易獲得、價值高的特點(diǎn)，在某些研究領(lǐng)域，如對腫瘤學(xué)的轉(zhuǎn)化研究或者對孕婦血漿中胎兒游離dna的發(fā)育學(xué)研究，深受科研工作者的重視。
圖1. thruplex®技術(shù)概要。thruplex plasma-seq kit技術(shù)3步反應(yīng)即可完成針對cell free dna的建庫工作。1~30 ng含量的cf dna首先高效的進(jìn)行末端修復(fù)。通過采用莖環(huán)形接頭（無單鏈尾巴）進(jìn)行高效平端連接，降低了背景。封閉的5’端阻止了接頭-接頭二聚體形成。隨后未使用的接頭被降解，進(jìn)一步降低背景。高保真度擴(kuò)增的方式完成以上反應(yīng)，并獲得含有illumina index的文庫。
（*圖片來源于takara bio usa,inc.）
圖2. 高cfdna文庫多樣性、更少的unmapped reads。thruplex plasma-seq kit構(gòu)建的文庫，具有高的多樣性和低的duplicates和unmapped reads。圖中表示cfdna分別提取于3份血漿樣品，文庫定量采用qubit熒光定量。bioanalyzer測定mononucleosomal dna在各樣品的量分別為0.09 ng、0.62 ng、15.44 ng。pooled libraries采用illumina nextseq 500 paired end模式測序，且每個文庫產(chǎn)生17 m到25 m reads。每個文庫在down-sampling數(shù)據(jù)至17 m reads以后，計(jì)算duplication rates。
（*圖片來源于takara bio usa,inc.）
圖3. 優(yōu)異的靶向測序文庫構(gòu)建能力。圖中所示thruplex plasma-seq kit構(gòu)建的文庫通過panel進(jìn)行高效捕獲，對kinome進(jìn)行深度測序分析以檢測突變。3個血漿樣品分別起始建庫量為5 ng、6.5 ng、10 ng，三次重復(fù)。目標(biāo)區(qū)域采用sureselectxt2的clearseq human dna kinome panel進(jìn)行捕獲，并用illumina miseq平臺進(jìn)行測序，平均每個文庫獲得5 m reads，目標(biāo)堿基被成功捕獲分析。
（*圖片來源于takara bio usa,inc.）
圖4. 高重復(fù)性的、無偏倚的gc覆蓋度。針對人類基因組，thruplex plasma-seq kit表現(xiàn)出高再現(xiàn)性、低偏倚g(shù)c覆蓋度ngs文庫構(gòu)建能力。9次獨(dú)立的血漿樣品文庫構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，thruplex重復(fù)性高于其它產(chǎn)品。文庫的制備是利用的1 ml血漿來源cfdna，后續(xù)采用illumina nextseq 500進(jìn)行測序。作為對比，a公司試劑構(gòu)建了4份獨(dú)立血漿樣品的文庫。
（*圖片來源于takara bio usa,inc.）
圖5. karolinska協(xié)會和cruk測試的結(jié)果。5 ng游離cf dna采用thruplex plasma seq kit進(jìn)行illumina文庫構(gòu)建。結(jié)果表明利用hiseq平臺進(jìn)行的low-pass wgs,每個文庫能獲得接近12.5 m reads。
（*以上數(shù)據(jù)來源于karolinska 協(xié)會，瑞典）
■ 產(chǎn)品組成
· template preparation buffer（red）· template preparation enzyme（red）· library synthesis buffer（yellow）· library synthesis enzyme（yellow）· library amplification buffer（green）· library amplification enzyme（green）· nuclease-free water（clear）· indexing reagents（blue）· quick protocol（n/a）
■ 保存
－20℃
dna ht dual index kits
dna ht dual index kits是與 thruplex或 picoplex文庫制備試劑盒搭配使用，用以構(gòu)建illumina測序文庫的index引物試劑盒。這些試劑盒包含illumina nextera®xt v2 index序列對應(yīng)的index引物，多可提供384種不同的雙端index，用于樣本混合測序時的區(qū)分。其中index引物預(yù)先分裝在4個不同條形碼標(biāo)記的index微孔板中，每個微孔板可提供不同的96種index組合（code no.r400660-r400663），index微孔板（96n sets a-d）的每個孔提供的量足夠進(jìn)行一次測序反應(yīng)；另一種是一套中有24個單獨(dú)的反應(yīng)管，每個反應(yīng)管中包含不同的雙端index組合（code no.r400664），且每個反應(yīng)管（24n）提供的量足夠進(jìn)行兩次測序反應(yīng)。
dna unique dual index kits
dna unique dual index kits是與 thruplex或 picoplex文庫制備試劑盒搭配使用，用以構(gòu)建illumina測序文庫的index引物試劑盒。這些試劑盒包含“idt for illumina ud”對應(yīng)的index引物，多可提供96種不同雙端index，用于樣本混合測序時的區(qū)分。index引物預(yù)先分裝在不同的4組各24個單獨(dú)的管中，其中每組可提供24種不同index引物組合（code no.r400665-r400668）。每個index引物管（24u sets a-d）提供的量足夠進(jìn)行兩次測序反應(yīng)。
dna single index kits
dna single index kits是與 thruplex或 picoplex文庫制備試劑盒搭配使用，用以構(gòu)建illumina測序文庫的index引物試劑盒。這些試劑盒包含與“truseq lt set a”序列對應(yīng)的index引物，可提供24種單端index，用于樣本混合測序時的區(qū)分。index引物預(yù)先分裝在不同的2組各12個單獨(dú)的管中，其中每組可提供12種不同index引物組合（code no.r400695和r400697）。每個index引物管（12u sets a-b）提供的量足夠進(jìn)行8次測序反應(yīng)。
圖1. thruplex®技術(shù)概要。thruplex plasma-seq kit技術(shù)3步反應(yīng)即可完成針對cell free dna的建庫工作。1~30 ng含量的cf dna首先高效的進(jìn)行末端修復(fù)。通過采用莖環(huán)形接頭（無單鏈尾巴）進(jìn)行高效平端連接，降低了背景。封閉的5’端阻止了接頭-接頭二聚體形成。隨后未使用的接頭被降解，進(jìn)一步降低背景。高保真度擴(kuò)增的方式完成以上反應(yīng)，并獲得含有illumina index的文庫。
（*圖片來源于takara bio usa,inc.）
圖2. 高cfdna文庫多樣性、更少的unmapped reads。thruplex plasma-seq kit構(gòu)建的文庫，具有高的多樣性和低的duplicates和unmapped reads。圖中表示cfdna分別提取于3份血漿樣品，文庫定量采用qubit熒光定量。bioanalyzer測定mononucleosomal dna在各樣品的量分別為0.09 ng、0.62 ng、15.44 ng。pooled libraries采用illumina nextseq 500 paired end模式測序，且每個文庫產(chǎn)生17 m到25 m reads。每個文庫在down-sampling數(shù)據(jù)至17 m reads以后，計(jì)算duplication rates。
（*圖片來源于takara bio usa,inc.）
圖3. 優(yōu)異的靶向測序文庫構(gòu)建能力。圖中所示thruplex plasma-seq kit構(gòu)建的文庫通過panel進(jìn)行高效捕獲，對kinome進(jìn)行深度測序分析以檢測突變。3個血漿樣品分別起始建庫量為5 ng、6.5 ng、10 ng，三次重復(fù)。目標(biāo)區(qū)域采用sureselectxt2的clearseq human dna kinome panel進(jìn)行捕獲，并用illumina miseq平臺進(jìn)行測序，平均每個文庫獲得5 m reads，目標(biāo)堿基被成功捕獲分析。
（*圖片來源于takara bio usa,inc.）
圖4. 高重復(fù)性的、無偏倚的gc覆蓋度。針對人類基因組，thruplex plasma-seq kit表現(xiàn)出高再現(xiàn)性、低偏倚g(shù)c覆蓋度ngs文庫構(gòu)建能力。9次獨(dú)立的血漿樣品文庫構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，thruplex重復(fù)性高于其它產(chǎn)品。文庫的制備是利用的1 ml血漿來源cfdna，后續(xù)采用illumina nextseq 500進(jìn)行測序。作為對比，a公司試劑構(gòu)建了4份獨(dú)立血漿樣品的文庫。
（*圖片來源于takara bio usa,inc.）
圖5. karolinska協(xié)會和cruk測試的結(jié)果。5 ng游離cf dna采用thruplex plasma seq kit進(jìn)行illumina文庫構(gòu)建。結(jié)果表明利用hiseq平臺進(jìn)行的low-pass wgs,每個文庫能獲得接近12.5 m reads。
（*以上數(shù)據(jù)來源于karolinska 協(xié)會，瑞典）
■ 產(chǎn)品組成
· template preparation buffer（red）· template preparation enzyme（red）· library synthesis buffer（yellow）· library synthesis enzyme（yellow）· library amplification buffer（green）· library amplification enzyme（green）· nuclease-free water（clear）· indexing reagents（blue）· quick protocol（n/a）
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