戈氏放線菌pcr試劉盒檢測常見問題的常見原因 ：
1. cdna產(chǎn)量的很低可能的原因：
1) rna模板質(zhì)量低
2) 對mrna濃度估計過高
3)反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足
4)同位素磷32過期
5)反應(yīng)體積過大，不應(yīng)超過50μl
2. 擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳分析時沒有條帶或條帶很淺
1)zui常見的原因在于您的反應(yīng)體系是pcr的反應(yīng)體系而不是rt-pcr的反應(yīng)體系
3) 與反應(yīng)起始時rna的總量及純度有關(guān)
4) 建議在試驗(yàn)中加入對照rna
5) *鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進(jìn)行pcr擴(kuò)增時，在總的反應(yīng)體系中的含量不要超過1/10
6) 建議用oligo(dt)或隨機(jī)引物代替基因特異性引物(gsp)用于*鏈合成。由于rna模板存在二級結(jié)構(gòu)，如環(huán)狀結(jié)果，有可能導(dǎo)致gsp無法與模板退火；或ssⅱ反轉(zhuǎn)錄酶無法從此引物進(jìn)行有效延伸。
7) 目的mrna中含有強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)，可以試用以下方法解決：
a. 將*鏈的反應(yīng)溫度提高至50℃。
b. 使用隨機(jī)六聚體代替oligo(dt)進(jìn)行*鏈反應(yīng)。
3. 產(chǎn)生非特異性條帶
1)用rt陰性對照檢測是否被基因組dna污染。如果rt陰性對照的pcr結(jié)果也顯示同樣條帶，則需要用dnase i重新處理樣品。
2)在pcr反應(yīng)中，非特異的起始擴(kuò)增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物tm 2至5℃的溫度下進(jìn)行退火，降低鎂離子或是目的dna的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。
3)由于mrna剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的rt-pcr結(jié)果。
4. 產(chǎn)生彌散(smear)條帶
1)在pcr反應(yīng)體系中*鏈產(chǎn)物的含量過高
2)減少引物的用量
3)優(yōu)化pcr反應(yīng)條件/減少pcr的循環(huán)次數(shù)
4)在用dnase處理被dna污染的rna樣品時，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，一般會顯示為彌散背景。
5. 產(chǎn)生大分子量的彌散條帶
1)大多數(shù)情況下是由于退火溫度過低而導(dǎo)致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的
2)對于長片段的pcr，建議將反應(yīng)體系中cdna的濃度稀釋至1:10(或1:100-1:200)
6. 在無反轉(zhuǎn)錄酶的情況下，對照rna獲得擴(kuò)增結(jié)果詳細(xì)解析關(guān)于elisa試劑盒的儲存于有效期多久
對于我們購買回來的elisa試劑盒儲存及有效期，相信大家都是根據(jù)盒子上的日期決定它的有效期的，但是如果我們實(shí)驗(yàn)開封過的試劑盒，怎么確定它有多久的有效期呢？這點(diǎn)可能很多人不知道該如何保存。不用擔(dān)心，我司為您詳細(xì)解析關(guān)于elisa試劑盒的儲存于有效期多久。
要注意的是，如果將試劑盒剛從冰箱里面拿出來就立即使用的話，可能會影響，其直接的后果是對一些弱陽性標(biāo)本的檢測出現(xiàn)假陰性。建議：先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鐘以上后，再進(jìn)行測定，以使試劑盒在elisa檢測試劑盒使用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是為了在后面的溫育反應(yīng)步驟中，能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度能較快地達(dá)到所要求的高度，以滿足測定要求。
已開封或者使用后，剩余試劑仍需按照試劑瓶標(biāo)簽所示的溫度保存，elisa檢測試劑盒開封后的酶標(biāo)板要加干燥劑后密封保存于-20℃，避免潮濕。
根據(jù)我司規(guī)定未開封的試劑盒：所有試劑均按試劑瓶標(biāo)簽上所示保存。請注意，收到試劑盒后請盡快將標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液a、檢測溶液b以及96孔板保存于-20℃。
老師們在使用后的試劑盒：剩余試劑仍需按照試劑瓶標(biāo)簽所示的溫度保存，開封后的酶標(biāo)板要加干燥劑后密封保存于-20℃，避免潮濕。
溫馨提示：試劑盒內(nèi)酶標(biāo)條可拆卸，按實(shí)驗(yàn)需求可分多次使用;使用后的剩余試劑盒建議在實(shí)驗(yàn)后1個月內(nèi)使用完畢。產(chǎn)品過期時間以盒子上的標(biāo)簽為準(zhǔn)，保質(zhì)期內(nèi)所有組分都確保是穩(wěn)定的。