了解和掌握植物離體線粒體制備的方法。
【實(shí)驗(yàn)原理】
線粒體是進(jìn)行呼吸氧化作用的細(xì)胞器，是能量的轉(zhuǎn)換器，為了對這個細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究，需要把它從細(xì)胞中分離出來，并測定其活性。
在接近生物材料自身的生理狀態(tài)(合適的ph、一定的滲透濃度和低溫條件)下破碎細(xì)胞，可采用分級離心方法將線粒體顆粒與其他細(xì)胞內(nèi)含物在亞細(xì)胞水平上分開，然后在一定的離心力下收集線粒體。針對植物組織比較脆弱及其細(xì)胞含有較大量的有機(jī)酸等特點(diǎn)，不宜采取激烈的破碎方式，根據(jù)不同種類材料靈活掌握介質(zhì)的ph。在介質(zhì)中加入一些高分子化合物可除去酚類的干擾。為了去除其它細(xì)胞器的污染，獲得純凈的線粒體，本實(shí)驗(yàn)采用蔗糖襯墊離心法進(jìn)行提取。
【儀器設(shè)備】
冰凍高速離心機(jī)、研缽或、組織搗碎機(jī)、制冰機(jī)、冰箱、100ml離心管、燒杯、培養(yǎng)皿、恒溫培養(yǎng)箱、移液器、紗布、漏斗、電子天平、容量瓶、磁力攪拌器等。
【材料及試劑】
1. 材料
挑選籽粒飽滿的綠豆種子20g，用沸水燙后，均勻鋪在帶有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，37℃恒溫培養(yǎng)箱下黑暗萌發(fā)3-4d。去掉種皮和胚根，用濾紙吸干表面水分，放在4°c冰箱備用。
2. 試劑
① 提取及洗滌介質(zhì)：50mmol/ltris-hcl 緩沖液，ph8.0。內(nèi)含0.3mol/l甘露醇、0.2mol/l蔗糖、1mmol/l edta、0.2mmol/l二硫蘇糖醇和1mg/ml pvp(聚乙烯基吡咯烷酮)； ② 懸浮介質(zhì)：除不加牛血清蛋白外，其余與提取介質(zhì)相同； ③ 蔗糖溶液：0.6mol/l蔗糖，全用懸浮介質(zhì)配制。
【實(shí)驗(yàn)步驟】
1. 離體線粒體的提取：稱取10g去除種皮及胚根的綠豆幼苗放在4°c冰箱中饑餓1h，然后迅速在冰浴中研磨，開始加入少量提取介質(zhì)，后加至材料體積的一倍。
2. 勻漿用4層紗布過慮，濾液在4℃、1000g離心10min。
3. 取上清液，4℃、11000g離心20min。
4. 棄上清液，向沉淀中加入提取介質(zhì)5ml，懸浮，4℃、11000g離心15min。 5. 棄上清液，收集沉淀，并懸浮于0.5ml懸浮介質(zhì)中。
6. 加入25ml洗滌介質(zhì)，4℃、1000g離心10min，取上清液，4℃保存?zhèn)溆谩?br>7. 取一干凈的50ml離心管，加入20ml0.6mol/l的蔗糖溶液，然后將上一步驟中經(jīng)過低速離心并洗滌過的線粒體懸液鋪在0.6mol/l的蔗糖溶液上，4℃、11000g離心20min，所得沉淀即為純化線粒體，用1ml懸浮介質(zhì)懸浮，4℃保存?zhèn)溆谩?br>8. 蛋白質(zhì)含量測定(考馬斯亮藍(lán)法)，根據(jù)所測定蛋白質(zhì)含量，用懸浮介質(zhì)將線粒體懸浮液稀釋成2mg蛋白質(zhì)/ml線粒體懸浮液，4℃保存?zhèn)溆谩?br>【實(shí)驗(yàn)原理】
氧電極又稱clark電極，由嵌在絕緣棒上的鉑和銀構(gòu)成，以氯化鉀溶液為電解質(zhì)，覆蓋一層15-20mm厚的聚乙烯或聚四氟乙烯薄膜，兩極之間為極化電壓。溶氧可透過薄膜進(jìn)入電極，在鉑陰極上還原，同時在極間產(chǎn)生擴(kuò)散電流，此電流與溶解氧濃度成正比。氧電極可以直接測量溶液中溶解氧的濃度，并且對溶液中氧的吸收或釋放所引起的濃度變化十分敏感。具有活性的線粒體，供給底物表現(xiàn)出呼吸耗氧，因此可用氧電極測定線粒體的活性即呼吸強(qiáng)度。