棉花內標準sad1基因染料法pcr試劑盒反應流程常規(guī)程序:
將pcr反應所需的成分配置完后，在pcr儀上于94-96℃預加熱幾十秒至幾分鐘，使模板dna充分變性，然后進入擴增循環(huán)。在每一個循環(huán)中，先于94℃保持30秒鐘使模板變性，然后將溫度降到復性溫度（一般50-60℃之間），一般保持30秒鐘，使引物與模板充分退火；在72℃保持1分鐘（擴增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成dna，完成一個循環(huán)。重復這樣的循環(huán)25～35次，使擴增的dna片段大量累積。最后，在72℃保持3-7min，使產物延伸完整，4℃保存。
2．復性（退火）和延伸溫度
復性的溫度是pcr擴增是否順利的關鍵因素，通常在50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的tm值決定。延伸溫度絕大多數設定為72℃。如果復性的溫度很高，可以將延伸溫度和復性溫度設置成同一溫度，變成二步法pcr。
3．反應時間
變性步驟一般使用30秒鐘，如果模板的g+c含量較高，或直接用細胞做模板，變性時間可適當延長。復性時間有30秒種一般是足夠的。延伸時間由擴增產物的大小決定，一般采用1kb用1分鐘來保證充足的時間。
4．循環(huán)次數
循環(huán)次數主要與模板的起始數量有關，在模板拷貝數為104～105數量級時，循環(huán)數通常為25～35次。
平臺效應（plateaueffect）：pcr擴增過程后期會出現(xiàn)的產物的積累按減弱的指數速率增長的現(xiàn)象。原因：底物和引物的濃度已經降低，dntp和dna聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低，產生的焦磷酸會出現(xiàn)末端產物抑制作用，非特異性產物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競爭作用，擴增產物自身復性，高濃度擴增產物變性不*。
5．pcr反應液的配制
pcr反應體系的配置方式有時也會影響反應的正常進行。常規(guī)方法與其它酶學反應一樣，在最后加入dna聚合酶。早期的pcr儀沒有帶加熱的蓋子，要求在反應液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā)。
對于使用具3’-5’外切活性的高溫dna聚合酶時，有時會擴增不出產物。在遇到這個問題時，如果將反應成分分開配制，a管含模板、引物和dntp，以及調整體積的h2o，b管含緩沖液、dna聚合酶和水，然后再將兩管溶液混合起來，可較好地克服這個問題。
按照常規(guī)的方法配制反應體系，有時會出現(xiàn)非特異性擴增的問題。熱啟動（hotstart）pcr操作方式可較好解決這一問題。將dntp、緩沖液，mg2+和primer先配制好，然后加入一粒蠟珠（如ampliwaxpcrqam100），加熱熔化，再冷卻，使蠟將溶液封住，最后加入模板和dna聚合酶等剩余成分。只有當pcr反應進入高溫階段后，蠟層熔化，所有反應成分才會混合在一起。