紫外分光光度法測定*中維生素a的含量
一、原理
維生素a的異丙醇溶液在325nm波長處有*大吸收峰，其吸光度與維生素a的含量成正比。
二、試劑
維生素a標(biāo)準(zhǔn)溶液：*85%（或*乙酸脂90%）經(jīng)皂化處理后使用。稱取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，用脫醛乙醇溶解使其濃度大約為1mg/ml。臨用前需進行標(biāo)定。取標(biāo)定后的維生素a標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成10 i.u/ml的標(biāo)準(zhǔn)使用液。
標(biāo)定：取維生素a溶液若干微升，用脫醛乙醇稀釋3.00ml，在325nm處測定吸光度，用此吸光度計算出維生素a的濃度。
c——維生素a的濃度g/ml
a——維生素a的平均吸光度值
s——加入的維生素a溶液量µl
e——1%維生素a的比吸光系數(shù)：
無水脫醛乙醇：取2g*溶入少量水中。取4g氫氧化鈉溶于溫乙醇中。將兩者傾入盛有1l乙醇的試劑瓶中，振搖后，暗處放置兩天（不時搖動促進反應(yīng)）。取上層清液蒸餾，棄去初餾液50ml。
*：用95%乙醇配制成1%的溶液。
1:1氫氧化鉀；0.5mol/l 氫氧化鉀；無水：不含過氧化物；異丙醇
三、操作步驟
1、樣品處理
皂化：稱取0.5-5g充分混勻的*于三角瓶中，加入10ml1:1氫氧化鉀及20-40ml乙醇，在電熱板上回流30分鐘。加入10ml水，稍稍振搖，若有混濁現(xiàn)象，表示皂化*。
提取：將皂化液移入分液漏斗，先用30ml水分兩次洗滌皂化瓶（若有渣，可用經(jīng)過脫脂棉過濾），再用50ml分兩次洗滌皂化瓶，所有洗液并入分液漏斗中，振搖兩分鐘（注意放氣），靜止分層后，水層放入**分液漏斗。皂化瓶再用30ml分兩次洗滌，洗液倒入**分液漏斗，振搖后靜止分層，將水層放入第三分液漏斗，醚層并入**分液漏斗。重復(fù)操作3次。
洗滌：向**分液漏斗的醚液中加入30ml水，輕輕振搖，靜止分層后放出水層。再加15-20ml0.5mol/l的氫氧化鉀溶液，輕輕振搖，靜止分層后放出堿液。再用水同樣操作至洗液不使*變紅為止。醚液靜止10-20分鐘后，小心放掉析出的水。
濃縮：將醚液經(jīng)過*濾入三角瓶中，再用約25ml洗滌分液漏斗和硫酸鈉兩次，洗液并入三角瓶中。用水浴蒸餾回收，待瓶中剩余約5ml時取下減壓抽干，立即用異丙醇溶解并移入50ml容量瓶中用異丙醇定容。
2、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
分別取維生素a標(biāo)準(zhǔn)使用液0.00,1.00,2.00,3.00,4.00,5.00ml于10ml容量瓶中用異丙醇定容。以零管調(diào)零，于紫外分光光度計上在325nm處分別測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3、樣品測定
取濃縮后的定容液于紫外分光光度計上在325nm處測定吸光度，通過此吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出維生素a的含量。
四、計算
維生素a（i.u/100g）=
c——測出的樣品濃縮后的定容液的維生素a的含量i.u/ml
v——濃縮后的定容液的體積ml
m——樣品的質(zhì)量g