rt-pcr是指將逆轉(zhuǎn)錄(reverse transcription；rt)反應(yīng)和pcr (polymerase chain reaction)反應(yīng)組合在一起的方法。
1、 rt-pcr的原理
rt-pcr將以rna為模板的cdna合成同pcr結(jié)合在一起，提供了一種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。rt-pcr用于對表達(dá)信息進(jìn)行檢測或定量。另外，這項(xiàng)技術(shù)還可以用來檢測基因表達(dá)差異或不必構(gòu)建cdna文庫克隆cdna。rt-pcr比其他包括northern印跡、rnase保護(hù)分析、原位雜交及s1核酸酶分析在內(nèi)的rna分析技術(shù)，更靈敏，更易于操作。
rt-pcr的模板可以為總rna或poly(a)+選擇性rna。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以隨機(jī)引物、oligo(dt)或基因特異性的引物（gsp）起始。rt-pcr可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法rt-pcr中，每一步都在最佳條件下進(jìn)行。cdna的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行pcr。在一步法rt-pcr中，逆轉(zhuǎn)錄和pcr在同時(shí)為逆轉(zhuǎn)錄和pcr優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進(jìn)行。
2、 rt-pcr的步驟
⑴在冰浴離心管里面加入模板rna 4ul，引物2ul，去離子水5ul，混勻，離心3-5秒；
⑵70度水浴5分鐘，冰浴30秒（此處是為了使引物和模板正確配對）；
⑶加入5×反應(yīng)液4ul，rnase抑制劑1ul，dntp 2ul（這些應(yīng)該先配好，然后分再裝到每一管），混勻；
⑷37度水浴5分鐘，加入1ul amv-rt反轉(zhuǎn)錄酶，混勻；
⑸37度水浴1小時(shí)（此步是反轉(zhuǎn)錄過程）；
⑹70度10分鐘結(jié)束反應(yīng)（此處是滅活酶活性，避免對后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾），產(chǎn)物置冰上進(jìn)行下一步pcr實(shí)驗(yàn)，余下的-70度保存。
3、 rt-pcr的引物設(shè)計(jì)
rt-pcr引物設(shè)計(jì)和一般pcr引物設(shè)計(jì)可以遵循同樣的原則。細(xì)心地進(jìn)行引物設(shè)計(jì)是pcr中最重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火。設(shè)計(jì)糟糕的引物可能會同擴(kuò)增其他的非目的序列。設(shè)計(jì)理想的引物都有以下共同的特點(diǎn)，而設(shè)計(jì)失敗的引物則各有各的缺點(diǎn)：
* 典型的引物18到24個(gè)核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨(dú)te性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯(cuò)誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。
* 選擇gc含量為40％到60％或gc含量反映模板gc含量的引物。
* 設(shè)計(jì)5'端和中間區(qū)為g或c的引物。這會增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。
* 避免引物對3'末端存在互補(bǔ)序列，這會形成引物二聚體，抑制擴(kuò)增。
* 避免3'末端富含gc。設(shè)計(jì)引物時(shí)保證在最后5個(gè)核苷中含有3個(gè)a或t。
* 避免3'末端的錯(cuò)誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
* 避免存在可能會產(chǎn)生內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的序列，這會破壞引物退火穩(wěn)定性。
目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點(diǎn)和啟動子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當(dāng)計(jì)算引物tm值時(shí)并不包括這些序列，但是應(yīng)該對其進(jìn)行互補(bǔ)性和內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的檢測。
引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μm濃度溶于te的引物在-20℃可以穩(wěn)定保存6個(gè)月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存2個(gè)月。
4、引物退火溫度
引物的另一個(gè)重要參數(shù)是熔解溫度（tm）。這是當(dāng)50％的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈dna分子時(shí)的溫度。tm對于設(shè)定pcr退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的tm低5℃。
根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，tm會差異很大。因?yàn)榇蟛糠止教峁┮粋€(gè)估算的tm值，所有退火溫度只是一個(gè)起始點(diǎn)。可以通過分析幾個(gè)逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開始低于估算的tm 5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得最佳結(jié)果，兩個(gè)引物應(yīng)具有近似的tm值。引物對的tm差異如果超過5℃，就會由于在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)誤起始。如果兩個(gè)引物tm不同，將退火溫度設(shè)定為比tm低5℃?；蛘邽榱颂岣咛禺愋?，可以在根據(jù)較高tm設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后再根據(jù)較低tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
5、提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度
較高的保溫溫度有助于rna二級結(jié)構(gòu)的打開，增加了反應(yīng)的產(chǎn)量。對于多數(shù)rna模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將rna和引物在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數(shù)二級結(jié)構(gòu)，從而使引物可以結(jié)合。然而某些模板仍然會存在二級結(jié)構(gòu)，即使熱變性后也是如此。較高的保溫溫度也可以增加特異性，尤其是當(dāng)使用基因特異性引物（gsp）進(jìn)行cdna合成時(shí)。如果使用gsp，確保引物的tm值與預(yù)計(jì)的保溫溫度相同。不要在高于60℃時(shí)使用oligo(dt)和隨機(jī)引物。隨機(jī)引物需要在增加到60℃前在25℃保溫10分鐘。除了使用較高的逆轉(zhuǎn)錄溫度外，還可以通過直接將rna/引物混合物從65℃變性溫度轉(zhuǎn)到逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度，并加入預(yù)熱的2×的反應(yīng)混合物提高特異性（cdna熱啟動合成）。這種方法有助于防止較低溫度時(shí)所發(fā)生的分子間堿基配對。使用pcr儀可以簡化rt-pcr所需的多種溫度切換。
6、 促進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄的添加劑
包括甘油和dmso在內(nèi)的添加劑加到第一鏈合成反應(yīng)中，可以減低核酸雙鏈的穩(wěn)定并解開rna二級結(jié)構(gòu)，最多可以加入20％的甘油或10％的dmso而不影響或mmlv的活性。amv也可以耐受最多20％的甘油而不降低活性。為了在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中最大限度提高rt-pcr的靈敏度，可以加入10％的甘油并在45℃保溫。如果1/10的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物加入到pcr中，那甘油在擴(kuò)增反應(yīng)中的濃度為0.4％，這不足以抑制pcr。
在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入rnase抑制劑以增加cdna合成的長度和產(chǎn)量。rnase抑制劑要在第一鏈合成反應(yīng)中，在緩沖液和還原劑（如dtt）存在的條件下加入，因?yàn)閏dna合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結(jié)合的可以降解rna的rnase。蛋白rnase抑制劑僅防止rnase a，b，c對rna的降解，并不能防止皮膚上的rnase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入rnase。
使用無rnaseh活性（rnaseh-）的逆轉(zhuǎn)錄酶：逆轉(zhuǎn)錄酶催化rna轉(zhuǎn)化成cdna，不管是m-mlv還是amv，在本身的聚合酶活性之外，都具有內(nèi)源rnaseh活性。rnaseh活性同聚合酶活性相互競爭rna模板與dna引物或cdna延伸鏈間形成的雜合鏈，并降解rna：dna復(fù)合物中的rna鏈。被rnaseh活性所降解的rna模板不能再作為合成cdna的有效底物，降低了cdna合成的產(chǎn)量和長度。因此消除或大大降低逆轉(zhuǎn)錄酶的rnaseh活性將會大有裨益。rnaseh-的mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶及rnaseh-的amv，比mmlv和amv能得到更多量和更多全長。rt-pcr靈敏度會受cdna合成量的影響。rt-pcr產(chǎn)物的大小受限于逆轉(zhuǎn)錄酶合成cdna的能力，尤其是克隆較大的cdna時(shí)。rnaseh-的逆轉(zhuǎn)錄酶可以顯著提高長rt-pcr產(chǎn)物的產(chǎn)量，同時(shí)增加了熱穩(wěn)定性，所以反應(yīng)可以在高于正常的37-42℃的溫度下進(jìn)行。
7、rnaseh處理
在pcr之前使用rnaseh處理cdna合成反應(yīng)可以提高靈敏度。對于某些模板，據(jù)認(rèn)為cdna合成反應(yīng)中的rna會阻止擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合，在這種情況下，rnaseh處理可以增加靈敏度。一般當(dāng)擴(kuò)增較長的全長cdna目標(biāo)模板時(shí)，rnaseh處理是必需的，比如低拷貝的。對這種困難模板，rnaseh的處理加強(qiáng)了或amv合成的cdna所產(chǎn)生的信號。對于多數(shù)rt-pcr反應(yīng)，rnaseh處理是可選的，因?yàn)?5℃保溫的pcr變性步驟一般會將rna：dna復(fù)合物中的rna水解掉。
8、 小量rna檢測方法的提高
當(dāng)僅有小量rna時(shí)，rt-pcr尤其具有挑戰(zhàn)性。在rna分離過程中加入的作為載體的糖元有助于增加小量樣品的產(chǎn)量?？梢栽诩尤雝rizol的同時(shí)加入無rnase的糖元。糖元是水溶性的，可以同rna保持在水相中以輔助隨后的沉淀。對于小于50mg的組織或106個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞的樣品，無rnase糖元的建議濃度為250μg/ml。
9、 一步法同兩步法rt-pcr的比較
兩步法rt-pcr比較常見，在使用一個(gè)樣品檢測多個(gè)mrna時(shí)比較有用。然而一步法rt-pcr具有其他優(yōu)點(diǎn)。一步法rt-pcr在處理大量樣品時(shí)易于操作，有助于減少殘余污染，因?yàn)樵赾dna合成和擴(kuò)增之間不需要打開管蓋。一步法可以得到更高的靈敏度，可以達(dá)到0.1pg總rna，這是因?yàn)檎麄€(gè)cdna樣品都被擴(kuò)增。對于成功的一步法rt-pcr，一般使用反義的基因特異性引物起始cdna合成。
10、 增加rt-pcr特異性
第一鏈cdna合成的起始可以使用三種不同的方法，各種方法的相對特異性影響了所合成cdna的量和種類。
隨機(jī)引物法是三種方法中特異性的。引物在整個(gè)轉(zhuǎn)錄本的多個(gè)位點(diǎn)退火，產(chǎn)生短的，部分長度的cdna。這種方法經(jīng)常用于**5'末端序列及從帶有二級結(jié)構(gòu)區(qū)域或帶有逆轉(zhuǎn)錄酶不能復(fù)制的終止位點(diǎn)的rna模板獲得cdna。為了獲得最長的cdna，需要按經(jīng)驗(yàn)確定每個(gè)rna樣品中引物與rna的比例。隨機(jī)引物的起始濃度范圍為50到250ng每20μl反應(yīng)體系。因?yàn)槭褂秒S機(jī)引物從總rna合成的cdna主要是核糖體rna，所以模板一般選用poly(a)+rna。
oligo(dt)起始比隨機(jī)引物特異性高。它同大多數(shù)真核細(xì)胞mrna 3'端所發(fā)現(xiàn)的poly(a)尾雜交。因?yàn)閜oly(a)+rna大概占總rna的1%到2％，所以與使用隨機(jī)引物相比，cdna的數(shù)量和復(fù)雜度要少得多。因?yàn)槠漭^高的特異性，oligo(dt)一般不需要對rna和引物的比例及poly(a)+選擇進(jìn)行優(yōu)化。建議每20μl反應(yīng)體系使用0.5μg oligo(dt)。oligo(dt)12-18適用于多數(shù)rt-pcr。thermoscript rt-pcr system提供了oligo(dt)20，因?yàn)槠錈岱€(wěn)定性較好，適用于較高的保溫溫度。
基因特異性引物（gsp）對于逆轉(zhuǎn)錄步驟是特異性引物。gsp是反義寡聚核苷，可以特異性地同rna目的序列雜交，而不象隨機(jī)引物或oligo(dt)那樣同所有rna退火。用于設(shè)計(jì)pcr引物的規(guī)則同樣適用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)gsp的設(shè)計(jì)。gsp可以同與mrna3'最末端退火的擴(kuò)增引物序列相同，或gsp可以設(shè)計(jì)為與反向擴(kuò)增引物的下游退火。對于部分?jǐn)U增對象，為了成功進(jìn)行rt-pcr，需要設(shè)計(jì)多于一個(gè)反義引物，因?yàn)槟康膔na的二級結(jié)構(gòu)可能會阻止引物結(jié)合。建議在20μl的第一鏈合成反應(yīng)體系中使用1pmol反義gsp。
11、 提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度
為了充分利用gsp特異性的全部優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)該使用有較高熱穩(wěn)定性的逆轉(zhuǎn)錄酶。熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶可以在較高溫度保溫以增加反應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)性。比如，如果一個(gè)gsp退火溫度為55℃，那么如果使用amv或m-mlv在低嚴(yán)謹(jǐn)性的37℃進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，gsp所帶有的特異性就沒有利用。然而某些特別的逆轉(zhuǎn)錄酶可以在50℃或更高進(jìn)行反應(yīng)，這就會消除較低溫度時(shí)產(chǎn)生的非特異性產(chǎn)物。為獲得最大的特異性，可以將rna/引物混合物直接從65℃變性溫度轉(zhuǎn)移到逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度。這有助于防止低溫時(shí)分子間堿基配對。使用pcr儀可以簡化rt-pcr所需的多種溫度轉(zhuǎn)換。
12、 減少基因組dna污染
rt-pcr所遇到的一個(gè)潛在的困難是rna中沾染的基因組dna。使用較好的rna分離方法，如trizol，會減少rna制備物中沾染的基因組dna。為了避免產(chǎn)生于基因組dna的產(chǎn)物，可以在逆轉(zhuǎn)錄之前使用擴(kuò)增級的dnaseⅰ對rna進(jìn)行處理以除去沾染的dna。將樣品在2.0mm edta中65℃保溫10分鐘以終止dnaseⅰ消化。edta可以螯合鎂離子，防止高溫時(shí)所發(fā)生的依賴于鎂離子的rna水解。
為了將擴(kuò)增的cdna同沾染的基因組dna擴(kuò)增產(chǎn)物分開，可以設(shè)計(jì)分別同分開的外顯子退火的引物。來源于cdna的pcr產(chǎn)物會比來源于沾染的基因組dna的產(chǎn)物短。另外對每個(gè)rna模板進(jìn)行一個(gè)無逆轉(zhuǎn)錄的對照實(shí)驗(yàn)，以確定一個(gè)給定片段是來自基因組dna還是cdna。在無逆轉(zhuǎn)錄時(shí)所得到的pcr產(chǎn)物來源于基因組。