介紹在過(guò)去的幾十年中，納米技術(shù)已經(jīng)很好地發(fā)展到構(gòu)建藥物遞送系統(tǒng)，包括但不限于膠束、脂質(zhì)體和納米顆粒[1-10]。與傳統(tǒng)制劑相比，這些納米級(jí)給藥系統(tǒng)（dds）在提高藥物穩(wěn)定性、防止藥物過(guò)早釋放、改變藥物分布和延長(zhǎng)藥物半衰期方面表現(xiàn)出巨大潛力[11]。因此，它們被廣泛用于各種藥物的輸送，包括抗癌藥物[1，2]，抗菌劑[3，4]和抗炎藥[5，6]等。
納米級(jí)dds雖然在單藥治療藥物方面表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)，但在提高多病因疾病綜合療效方面仍存在諸多局限性。事實(shí)上，許多常見的臨床疾病是由多種因素相互作用引起的或惡化的。例如，燒傷創(chuàng)面感染常因細(xì)菌感染而加重，例如銅綠假單胞菌（銅綠假單胞菌）和金黃色葡萄球菌（金黃色葡萄球菌）[12]。當(dāng)肝實(shí)質(zhì)和代謝功能的大量喪失誘發(fā)急性肝衰竭時(shí)，患者將變得易感病原體，這在很大程度上限制了晚期緊急肝移植的可行性[13]。另?yè)?jù)報(bào)道，細(xì)菌感染可能是誘導(dǎo)腫瘤形成的主要原因之一， 因此，應(yīng)同時(shí)采用抗癌和抗菌措施治療這些疾病，例如幽門螺桿菌誘發(fā)的胃癌[14]。因此，為了治療多因素疾病，應(yīng)合理開發(fā)dds，以共同遞送治療劑和抗菌劑，如抗生素[3]、抗菌肽[15，16]、金屬離子[4]和天然化合物[17]。
為此，最常見的策略之一是在一個(gè)制劑中共同遞送兩種或兩種以上的藥物[18，19]。然而，由于納米載體的載藥空間有限，共遞送策略通常無(wú)法同時(shí)實(shí)現(xiàn)多種藥物的充分載樣[18-20]。最近，聚（異賴氨酸）（pll）基聚合物已被制造用于封裝帶負(fù)電荷的藥物，例如小分子藥物[21-23]，蛋白質(zhì)[24，25]和核酸[26，27]。值得注意的是，qiao等人[15]發(fā)現(xiàn)基于pll的聚合物具有類似于普通抗菌肽（amp）的殺菌機(jī)制，具有去除細(xì)菌感染的巨大潛力。我們之前的研究[16]還表明，多臂pll（mpll）具有高抗菌活性、巨大的選擇性和顯著的蛋白水解穩(wěn)定性， 代表了一系列治療耐藥感染的強(qiáng)效抗菌肽[16]。所有這些研究進(jìn)展都預(yù)測(cè)，基于pll的聚合物不僅可以作為藥物載體，還可以作為具有治療活性的大分子來(lái)協(xié)同治療效果，這意味著納米醫(yī)學(xué)針對(duì)多因素疾病的設(shè)計(jì)有了新的視角。
在這項(xiàng)研究中，設(shè)計(jì)、合成和評(píng)估了mpll-alt-peg（方案1）形式的聚乙二醇（peg）交聯(lián)交替共聚物，作為陰離子藥物遞送和抗菌的平臺(tái)。具有支化聚乙烯亞胺（pei）核心和聚（i-賴氨酸）外圍鏈的mpll構(gòu)成了mpll-alt-peg共聚物的聚電解質(zhì)段。它們的多臂分子結(jié)構(gòu)具有較高的陽(yáng)離子電荷密度，有利于通過(guò)靜電相互作用增強(qiáng)對(duì)陰離子藥物和細(xì)菌脂質(zhì)雙層的結(jié)合親和力[16]。預(yù)計(jì)mpll-alt-peg可以包封陰離子藥物，然后自組裝成殼交聯(lián)聚離子復(fù)合物（pic）膠束（方案1）。 我們之前的研究表明，殼交聯(lián)膠束可能具有優(yōu)勢(shì)，無(wú)效載藥，提高膠束穩(wěn)定性，并保護(hù)藥物免于過(guò)早釋放和降解[28]。同時(shí)，交聯(lián)后mpll的抗菌活性也可以提高，因?yàn)榻宦?lián)反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致分子量、蛋白水解穩(wěn)定性和體內(nèi)半衰期增加[16，29]。載藥mpll-alt-peg膠束可以整合負(fù)載藥物的治療效果和載體的抗菌活性。我們證明了mpll-alt-peg作為小分子藥物和治療性生物大分子的dds的可行性，使用水溶性甲基橙（mo）和免疫激素重組人干擾素-a-2b（ifn）作為陰離子模型藥物。隨后 以革蘭陽(yáng)性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（mrsa）和革蘭陰性銅綠假單胞菌為模型菌，研究了mpll-alt-peg的抗菌活性和機(jī)制。我們預(yù)計(jì)基于mpll-alt-peg的納米平臺(tái)可以作為治療細(xì)菌感染涉及多因素疾病的潛在系統(tǒng)。
2.材料與方法2.1.材料支化pei（mw = 0.8 kda）是從sigma-aldrich（中國(guó)上海）獲得的。g-芐氧羰基-l-賴氨酸（zll）購(gòu)自gl biochem（中國(guó)上海），無(wú)需進(jìn)一步純化即可使用。peg（琥珀酰亞胺羧甲酯）2（scm-peg-scm，mw = 7.5 kda）由jenkem科技有限公司（中國(guó)北京）提供。甲基橙、苯甲醚、甲磺酸、和異硫氰酸熒光素（fitc）均來(lái)自阿拉?。ㄖ袊?guó)上海）。viskase（美國(guó)伊利諾伊州達(dá)連）生產(chǎn)了分子量截止值（mwco）為7和14 kda的透析管，而50 kda和100 kda的透析管則從spectrum laboratories inc.（美國(guó)加利福尼亞州洛杉磯）購(gòu)買。ifn（500萬(wàn)u）是從安徽安科生物科技有限公司（中國(guó)安徽）獲得的。2.2.mpll-alt-peg共聚物的合成與表征在pei引發(fā)的e-芐氧羰基-l-賴氨酸n-羧酸酐（zll-nca）聚合的連續(xù)過(guò)程中合成mpll-alt-peg共聚物，以制備pei接枝聚（e-芐氧羰基-l-賴氨酸）（pez），然后與雙官能團(tuán)scm-peg-scm進(jìn)行外圍交聯(lián)，隨后去除芐氧羰基側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)（圖1）。第一步，根據(jù)我們之前的報(bào)告，zll在無(wú)水乙酸乙酯中光氣化（收率：78%）制備zll-nca，然后以pei為大分子引發(fā)劑聚合d，得到星嵌段共聚物pez（產(chǎn)率：92%）[16，24，28，30]。
然后，將100mgpez溶解在50mldmso和250ml二氯甲烷（dcm）的混合物中。將dcm中濃度為0.2g-ml-1的scm-peg-scm溶液滴加到pez溶液中，在25°c劇烈攪拌條件下滴加24小時(shí)，產(chǎn)生pez-alt-peg[28]。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮溶液以除去dcm，并透析（mwco 14 kda）對(duì)水。隨后，通過(guò)凍干得到pez-alt-peg共聚物。產(chǎn)率：95%。
最后，將pez-alt-peg溶于tfa中，然后加入苯甲醚和甲磺酸，室溫?cái)嚢?.5h后，用蒸餾水稀釋溶液，洗滌3次。收集水層，然后用碳酸氫鈉中和。之后，將樣品轉(zhuǎn)移到透析管（mwco 7 kda）中，并在5.0wt%nahcog水溶液下透析兩天，隨后在蒸餾水中透析五天。然后將透析產(chǎn)物凍干以獲得最終產(chǎn)物mpll-alf-peg。產(chǎn)量： 91 %以dmso-m為溶劑，在布魯克dmx 400 mhz波譜儀（德國(guó)卡爾斯魯厄布魯克）上端接p ez和pez-alt-peg的核磁共振（nmr）波譜，而mpll-alt-peg以d2 o為溶劑。各種cop聚合物的分子量通過(guò)配備沃特世51 5 hplc泵和沃特世2414折光率檢測(cè)器的凝膠滲透色譜（gpc）系統(tǒng)（美國(guó)米爾福德沃特斯）測(cè)定。為了表征pez和pez-alt-peg，使用線性聚甲基丙烯酸甲酯（pmmas）作為標(biāo)準(zhǔn)品，以二甲基甲酰胺（dmf）為洗脫液分析樣品。為了表征mpll-alt-peg，對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)量，并使用0.50 m h ac-n和ac緩沖液（ph 4.5）作為淋洗液，線性peg作為st標(biāo)準(zhǔn)品。
2.3.載藥mpll-alt-peg膠束的制備與表征為了評(píng)估m(xù)pll-alt-peg對(duì)小陰離子分子的封裝，將給定量的mo加入到水中的mpll-alt-peg溶液中（10ml）中并攪拌5分鐘。然后將獲得的溶液在下沉條件下對(duì)水透析（mwco 50 kda）以除去游離客體分子。在相同條件下，選擇具有等量游離mo的溶液作為透析對(duì)照。當(dāng)對(duì)照組mo溶液透析至無(wú)色時(shí)，得到mo/mpll-alt-peg膠束，用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定透析液中mo的含量。采用標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線定量0.1-6 mg-l-1濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)（r2）>0.99的mo，載藥量以mo對(duì)聚合物的質(zhì)量百分比計(jì)算。
為了評(píng)估m(xù)pll-alt-peg對(duì)陰離子生物大分子的包封，按照?qǐng)?bào)道的方法用fitc標(biāo)記ifn[31]。隨后，將mpll-alt-peg和fitc標(biāo)記的ifn（fitc-ifn）溶液分別溶解在濃度為2mg-ml-1的0.01m磷酸鹽緩沖液（ph 7.4）中。然后將1 ml ifn溶液滴加到5 ml聚合物溶液中，在超聲儀上超聲處理5 min（kq-200 kde，昆山超聲儀器有限公司 中國(guó)昆山，40 khz，100 w），然后在下沉條件下用0.01 m磷酸鹽緩沖液（ph 7.4）透析（mwco 100 kda）。游離fitc-ifn在0.01m磷酸鹽緩沖液（ph 7.4）中也作為對(duì)照進(jìn)行透析。當(dāng)對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的游離ifn去除后，使用fitc-ifn的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線，使用fitc-ifn的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線，通過(guò)spectramax gemini xs微孔板熒光計(jì)（分子器件合作，美國(guó)加利福尼亞州桑尼維爾）測(cè)量外透析液中fitc-ifn的量，然后從添加的fitc-ifn總量中減去該值以計(jì)算fitc-ifn的負(fù)載量。載藥量計(jì)算為fitc-ifn對(duì)聚合物的質(zhì)量百分比。
使用jeol jem-1400透射電子顯微鏡在100 kv的工作電壓下觀察成型膠束的形貌（jeol，日本東京）。使用zetasizer nano zs90（英國(guó)伍斯特郡馬爾文儀器有限公司）在25°c下記錄聚合物和膠束的粒徑和zeta電位。測(cè)試前使用0.01 m磷酸鹽緩沖液（ph 7.4）將溶液稀釋至1 mg-ml-1。
2.4.ph 敏感釋放從膠束將裝有fitc-ifn的膠束溶液（5 ml）轉(zhuǎn)移到透析袋（mwco 100 kda）中，然后將袋子放入150 ml的0.02 m磷酸鹽緩沖液（ph 7.4）、0.02 m hac-naac緩沖液（ph 5.5）或0.02 m hac-naac緩沖液（ph 4.5）中。聚合物/fitc-ifn配合溶液的制備如第2.3節(jié)所述。以預(yù)定的時(shí)間間隔，抽出給定體積的釋放培養(yǎng)基并補(bǔ)充等體積的新鮮緩沖溶液。用微孔板熒光計(jì)測(cè)定ifn的釋放量，計(jì)算藥物的累積釋放量，并繪制藥物釋放的百分比與時(shí)間的關(guān)系圖。所有實(shí)驗(yàn)一式兩份進(jìn)行。
2.5.最小抑菌濃度（mic）的測(cè)量采用肉湯微量稀釋法研究了聚合物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性mrsa和革蘭氏陰性銅綠假單胞菌的抗菌活性。將細(xì)菌細(xì)胞在37°c的mueller hinton肉湯（mhb）培養(yǎng)基中以300rpm不斷振蕩以達(dá)到中期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段。將微生物懸浮液稀釋并調(diào)節(jié)至2 x 105菌落形成單位（cfu）-ml-1。使用mhb對(duì)聚合物進(jìn)行一系列兩倍稀釋，細(xì)菌濃度范圍為60至0.2^m。將每種稀釋的聚合物溶液共50個(gè)加入到96孔微孔板中，然后加入50 rl細(xì)菌懸浮液，得到1 x 105 cfu-ml-1的最終接種物。在37°c孵育18小時(shí)后，用酶標(biāo)儀（synergy ht， biotek instruments inc.，winooski，vt，美國(guó)）。未添加聚合物處理的細(xì)菌細(xì)胞和未添加細(xì)菌的聚合物溶液分別用作陽(yáng)性和陰性對(duì)照。mic被定義為18小時(shí)后抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的濃度。
2.6.溶血測(cè)定新鮮小鼠血液用k2edta處理，用磷酸鹽緩沖溶液（pbs）洗滌3次，然后以1000g離心10分鐘以分離紅細(xì)胞。然后，獲得紅細(xì)胞并用pbs（ph 7.4）稀釋至終濃度為5%（v / v）。將50 rl不同濃度的聚合物溶液與等體積的紅細(xì)胞懸浮液在96孔微孔板上混合，然后孵育1hat37°c。 以1000x g 離心10分鐘后，將上清液的等分試樣（30rl）轉(zhuǎn)移到另一個(gè)96孔微孔板中，并用100rl的pbs稀釋。
通過(guò)使用biotek synergy th酶標(biāo)儀在540nm處測(cè)量吸光度來(lái)監(jiān)測(cè)紅細(xì)胞懸浮液中血紅蛋白的釋放。用2%triton x-100裂解的紅細(xì)胞的吸光度用作陽(yáng)性對(duì)照，并采取100%溶血，而pbs溶液中未經(jīng)處理的紅細(xì)胞懸浮液用作陰性對(duì)照。同時(shí)，應(yīng)用聚合物溶液對(duì)照樣品排除聚合物吸收干擾（假陽(yáng)性結(jié)果），并根據(jù)報(bào)告的方法檢查是否存在假陰性結(jié)果[32]。每次測(cè)試重復(fù)三次。根據(jù)以下公式（1）計(jì)算溶血百分比：溶血 （%）=[（久樣品 — a 陰性）/0 陽(yáng)性 — 久陰性）] x 100% （1） 其中 a 樣品代表處理樣品的吸光度，^陰性代表陰性對(duì)照的吸光度，a陽(yáng)性代表陽(yáng)性對(duì)照的吸光度。
本研究中的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行，并得到汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)（sumc2016-200，2016年12月5日）的批準(zhǔn)。
2.7.微生物的成像研究使用類似于mic測(cè)定的方案在2x mic下生長(zhǎng)并與聚合物混合細(xì)菌細(xì)胞。在37°c孵育90分鐘后，收集細(xì)菌細(xì)胞，用pbs（5000x g，10分鐘）洗滌兩次，并在4°c下用等體積的2.5%戊二醛溶液固定4小時(shí)。 將細(xì)菌細(xì)胞在0.1m pbs（5000x g，10分鐘）中沖洗，并進(jìn)一步固定在1%鋨酸（4°c中2小時(shí)）。在0.1m pbs中沖洗后，通過(guò)分級(jí)系列乙醇（30-100%）使細(xì)胞脫水。
為了通過(guò)場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（fe-sem）觀察，將脫水樣品轉(zhuǎn)移到乙醇和乙酸異戊酯的1：1混合物中30分鐘，然后轉(zhuǎn)移到絕對(duì)乙酸異戊酯中1 h。對(duì)樣品進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥，濺射涂覆一層薄薄的金，并用fe-sem（su8010;日立，東京，日本）。為了通過(guò)透射電子顯微鏡（tem）觀察，將脫水樣品轉(zhuǎn)移到丙酮中20 min，轉(zhuǎn)移到丙酮和spurr樹脂的1：1混合物中1 h，然后轉(zhuǎn)移到樹脂和無(wú)水丙酮的3：1混合物中3 h。最后，將樣品轉(zhuǎn)移到spurr樹脂中并孵育過(guò)夜。獲得厚度為70-90nm的切片，并在tem設(shè)置下進(jìn)行tem觀察之前用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛染色10分鐘（h-7650，日立，東京，日本）。
aa blocks提供全面的構(gòu)建塊和專門設(shè)計(jì)產(chǎn)品來(lái)支持您的研發(fā)：
.
.
.聚乙二醇交聯(lián)多臂聚（l-賴氨酸）具有包封能力和抗菌活性，可用于感染相關(guān)多因素疾病的潛在治療