巖藻多糖的制備方法與生物活性研究！
一、背景及概述
巖藻多糖(fucoidin) 是一類含有l(wèi)-巖藻糖和硫酸基團(tuán)的水溶性多糖，也稱褐藻多糖硫酸酯、褐藻糖膠，主要來源于褐藻、紅藻和一些海洋無脊椎動(dòng)物。低分子量巖藻多糖具有抗凝血、抗病毒、抗血栓、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等活性，被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域和現(xiàn)代食品工業(yè)。
二、制備方法
方法一、
一種酶法提取海藻中巖藻多糖的工藝，其步驟包括：
（1）海藻預(yù)處理：將干燥的海藻剪切成適宜大小，然后用粉碎機(jī)粉碎成粉末狀，向該海藻粉末中加入7～15倍（重量比）的水，于30～80℃水浴中浸泡2～8 h，使其充分吸水溶脹。
（2）巖藻多糖的提取：向上述充分吸水溶脹的海藻浸泡液中加入為海藻重量的0.03～1.2%復(fù)合纖維素酶，控制ph 3.5～6.0，30～50℃下反應(yīng)4～15 h；然后加入為海藻重量的0.01～0.8%復(fù)合蛋白酶，控制ph 6.5～10，上述溫度下反應(yīng)2～8 h。反應(yīng)結(jié)束后，離心分離酶解液，殘?jiān)尤肷倭克浞謹(jǐn)嚢琛㈦x心，合并兩次酶解液，此酶解液中除含有巖藻多糖外，還包含一定量的海藻酸、蛋白質(zhì)以及其它雜質(zhì)。
（3）巖藻多糖的分離純化：上述得到的酶解液先用硫酸調(diào)節(jié)ph 2～4.5，將其中的海藻酸類物質(zhì)沉淀出來，然后加入石灰水，調(diào)節(jié)溶液的ph為6～9，過濾，進(jìn)一步除去海藻酸雜質(zhì)；澄清濾液在70～85℃經(jīng)雙效濃縮為原體積的1/2～1/4，然后加入1～3倍體積的乙醇，使其中的巖藻多糖沉淀出來，最后經(jīng)多次脫水、烘干得到高純度巖藻多糖產(chǎn)品。
方法二、
一種均一性小分子巖藻多糖的制備方法，所述方法為：(1)粗巖藻多糖提?。簩⒏珊Х叟c溶劑混合，在60-100℃浸提1-5h，將浸提液離心(優(yōu)選5000-10000r/min)，獲得提取液；并將提取液減壓濃縮至1/2-1/15體積(優(yōu)選50℃-70℃減壓濃縮至1/10)，獲得濃縮液；所述溶劑為體積濃度95％乙醇水溶液或去離子水；所述溶劑體積用量以干海帶粉質(zhì)量計(jì)為25-50ml/g(優(yōu)選30ml/g)；然后向濃縮液中加質(zhì)量濃度1％～4％cacl2水溶液，攪拌至無沉淀產(chǎn)生(優(yōu)選攪拌4h)，離心，取上清液濃縮至1/2～1/3倍體積后，采用sevage法除蛋白直至水層與sevage溶液層中間未出現(xiàn)白色層，取水層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去殘留的氯仿，用14kda透析袋于去離子水中透析；取截留液加入無水乙醇至乙醇體積濃度為50％-90％，攪拌，在4℃下靜置過夜，離心，沉淀干燥，得粗巖藻多糖；(2)粗巖藻多糖純化：將粗巖藻多糖用去離子水溶解后，上樣deae-52纖維素陰離子交換柱，分別用去離子水，0.3m nacl水溶液、0.6m nacl水溶液、0.9m nacl水溶液、1.5m nacl水溶液、2.0m nacl水溶液進(jìn)行洗脫，分別收集0.9m nacl水溶液、1.5m nacl水溶液、2.0m nacl水溶液對(duì)應(yīng)的三種流出液，分別用14kda透析袋于去離子水中透析，取截留液凍干(12-24h)，分別獲得三種純化巖藻多糖；(3)小分子巖藻多糖的制備：將步驟(2)獲得的三種純化巖藻多糖用濃度為0.01～0.2mol/l的hcl水溶液制成質(zhì)量濃度為0.5～5％的巖藻多糖溶液，于30℃-100℃下攪拌水解10min-2h，反應(yīng)液調(diào)ph為7(優(yōu)選用1mol/l的naoh)后，用3.5kda透析袋于去離子水中透析24h，取截留液濃縮至1/3體積后，加入體積濃度10～30％h2o2水溶液溶解，再加入體積濃度5～20％氨水調(diào)節(jié)ph為8.5，室溫(25-30℃)避光放置30min，離心，上清液用3.5kda透析袋于去離子水中透析，凍干，分別獲得三種小分子巖藻多糖，所述小分子巖藻多糖分子量均小于10kda，優(yōu)選5-9kda。
三、生物活性
吳俊仙等人探討了巖藻多糖抑制炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,ibd)的作用及其機(jī)制。方法:將小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組(每組5只),實(shí)驗(yàn)組給予巖藻多糖灌胃2周,對(duì)照組給予飲用水灌胃2周,隨后兩組小鼠均自由飲用溶有葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium salt,dss)的水溶液,構(gòu)建ibd小鼠模型。檢測(cè)小鼠體重、脾臟重量、結(jié)腸長(zhǎng)度及重量,he染色觀察結(jié)腸組織病理變化,觀察大便性狀并評(píng)分;運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量pcr(real-time fluorescence quantitative pcr,qpcr)檢測(cè)炎癥因子、趨化因子和緊密連接蛋白的mrna水平變化。結(jié)果:巖藻多糖處理的實(shí)驗(yàn)組小鼠腸炎相關(guān)指標(biāo)顯著優(yōu)于對(duì)照組,炎癥程度減弱。結(jié)論:巖藻多糖能夠預(yù)防和抑制ibd的發(fā)生,為預(yù)防和治療ibd提供新方法和依據(jù)。
目前，科學(xué)家們?cè)隗w外和體內(nèi)的研究已經(jīng)證明了巖藻多糖的抗腫瘤的作用，包括在各種癌癥細(xì)胞中抑制生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、血管生成和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，巖藻多糖還能夠與巨噬細(xì)胞作用產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，從而間接抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。巖藻多糖還具有免疫調(diào)節(jié)作用，因此在與化療藥物及放療進(jìn)行聯(lián)合使用時(shí)，可緩解化療帶來的副作用。