1.將兩種寡核苷酸各1μg加入微量離心管中，加水至17 μl，再加2 μl 的10×測序酶緩沖液。70℃加熱5 min，然后在合適的退火溫度下保溫5 min，取2 μl 留待以后的分析。
2.加2μl 4種dntp混合液和10u測序酶，30℃溫育30min。
3.70℃ 10min 滅活dna聚合酶，取2 μl 留待以后的分析。
4.加10×限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，加水和20——100 u 的適合于克隆的限制性內(nèi)切酶至100 μl。適當(dāng)?shù)臏囟认孪? h以上。
5.酚抽提，加100 μl 4 mol/l 乙酸銨和400 μl的無水乙醇，-70℃沉淀15 min，離心5 min，沉淀重懸于100 μl te緩沖液，用乙醇再沉淀一次，用95%乙醇洗滌沉淀，干燥，20 μl te緩沖液溶解，取2 μl用于以后的分析。
6.用篩分型瓊脂糖凝膠電泳分析確證原材料、延伸產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物，估計(jì)延伸的寡核苷酸的量，再用適當(dāng)?shù)妮d體亞克隆。
7.對幾個(gè)合適的亞克隆測序。