果糖-1,6-二磷酸酶(fructose 1,6-bisphosphatase，fbp)試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法100管/96樣
注意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
果糖-1,6二磷酸酶又稱(chēng)果糖1,6二磷酸酯酶，催化1,6二磷酸果糖和水生成6磷酸果糖和無(wú)機(jī)磷，在糖的異生代謝和光合作用同化物蔗糖的合成中起關(guān)鍵性的作用。
測(cè)定原理：
fbp催化1,6二磷酸果糖和水生成6磷酸果糖和無(wú)機(jī)磷，在反應(yīng)體系中添加的磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和nadph，340nm下測(cè)定nadph增加速率，即可計(jì)算fbp活性。
需自備的儀器和用品：
分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液一：液體100ml×1瓶，4℃保存。
提取液二：液體100ml×1瓶，4℃保存。
試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入20ml試劑四充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存；
試劑二：液體7.2μl×1支，4℃保存；臨用前加入1ml蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存；
試劑三：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加入1ml蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存；
試劑四：液體25ml×1瓶，4℃保存；
樣本的前處理：
①總fbp酶提?。航ㄗh稱(chēng)取約0.1g樣本，加入1ml提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200w，破碎3s，間歇7s，總時(shí)間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測(cè)定。
②胞漿和葉綠體fbp酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5～10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g樣本，加入1ml提取液一），冰浴勻漿后于4℃，200g離心5min，棄沉淀，取上清在4℃，8000g離心10min，取上清用于測(cè)定胞漿fbp酶活性，取沉淀加1ml提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200w，破碎3s，間歇7s，總時(shí)間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測(cè)定葉綠體中fbp酶活性。
建議測(cè)定總fbp酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測(cè)定胞漿和葉綠體中的fbp，則按照步驟②提取粗酶液。
測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、將試劑一、二、三37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)預(yù)熱10分鐘。
3、加樣表：
試劑名稱(chēng)（μl）
測(cè)定管
樣本
20
試劑二
10
試劑三
10
試劑一
160
將上述試劑按順序加入微量石英比色皿或96孔板中，立即混勻，加入最后一個(gè)試劑的同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，在340 nm波長(zhǎng)下記錄反應(yīng)1min后吸光度a1和反應(yīng)6min后的吸光度a2，計(jì)算δa=a2-a1。
fbp活性計(jì)算：
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的nadph定義為一個(gè)酶活力單位。
fbp（nmol/min/mg prot）＝[δa×v反總÷（ε×d）×109]÷(v樣×cpr) ÷t=321.5×δa÷cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的nadph定義為一個(gè)酶活力單位。
fbp（nmol/min/g 鮮重）＝[δa×v反總÷（ε×d）×109]÷(w ×v樣÷v樣總) ÷t=321.5×δa÷w
v反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4l；ε：nadph摩爾消光系數(shù)，6.22×103l / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；v樣：加入樣本體積，0.02ml；v樣總：加入提取液體積，1 ml；t：反應(yīng)時(shí)間，5 min；cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；w：樣本質(zhì)量，g。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的nadph定義為一個(gè)酶活力單位。
fbp（nmol/min/mg prot）＝[δa×v反總÷（ε×d）×109]÷(v樣×cpr) ÷t=643×δa÷cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的nadph定義為一個(gè)酶活力單位。
fbp（nmol/min/g 鮮重）＝[δa×v反總÷（ε×d）×109]÷(w ×v樣÷v樣總) ÷t=643×δa÷w
v反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4l；ε：nadph摩爾消光系數(shù)，6.22×103l / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；v樣：加入樣本體積，0.02ml；v樣總：加入提取液體積，1 ml；t：反應(yīng)時(shí)間，5 min；cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；w：樣本質(zhì)量，g。