組織切片的特殊染色結(jié)果圖可以顯示組織中的特定物質(zhì)或結(jié)構(gòu)，通常使用拍照或目測(cè)的形式進(jìn)行對(duì)比和判別，但是想要更直觀的分析比較或者讓結(jié)果在文章里更有說(shuō)服力就需要對(duì)染色結(jié)果圖進(jìn)行定量或半定量的取值分析。目前sci高分文章常用的兩種對(duì)特殊染色結(jié)果圖進(jìn)行定量分析的方法如下：
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利用一定量特定溶劑洗脫與目標(biāo)物質(zhì)或結(jié)構(gòu)結(jié)合的染料，之后測(cè)定洗脫液在特定波長(zhǎng)下的吸光度，最后基于染料標(biāo)曲對(duì)切片中的特定物質(zhì)或結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量分析。
2
利用圖像處理軟件（如image j或ipp）進(jìn)行處理，提取陽(yáng)性區(qū)域像素面積或灰度，進(jìn)而半定量計(jì)算陽(yáng)性區(qū)域占總面積的百分比，或者計(jì)算陽(yáng)性區(qū)域的平均灰度值或光密度值。
吸光光度法
（洗脫分析）
通過(guò)洗脫進(jìn)行半定量分析方法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于找到一種特異性洗脫陽(yáng)性染料而不洗脫其他染料的洗脫劑，索萊寶的染色試劑盒可用于洗脫陽(yáng)性染料后半定量分析的產(chǎn)品包括鈣鹽的茜素紅染色、酸性糖蛋白的阿利新藍(lán)染色、中性脂質(zhì)的油紅o染色和膠原蛋白天狼星紅染色等等。洗脫測(cè)定法對(duì)樣本大小，染色狀態(tài)和洗脫體積要求較高，通常只用于細(xì)胞樣本的結(jié)果進(jìn)行定量分析。
茜素紅染色（g1452/g3280/g3281）：茜素紅常用來(lái)指示骨組織或者骨細(xì)胞中的鈣鹽，標(biāo)記為紅色，洗脫時(shí)需要用到10%的十六烷基吡啶（c9890）溶液。以骨細(xì)胞為例，細(xì)胞應(yīng)按照適宜的濃度在96孔板中培養(yǎng)，按照正常程序染色骨細(xì)胞中的鈣鹽，染色之后用蒸餾水沖洗干凈，將蒸餾水甩干后加入洗脫液孵育足夠的時(shí)間使結(jié)合在細(xì)胞上的茜素紅充分洗脫，最后檢測(cè)洗脫溶液的吸光度值，茜素紅的檢測(cè)波長(zhǎng)為562nm。
油紅o染色（g1260/g1261）：油紅o染色常用來(lái)指示各種組織中的脂肪堆積，與傳統(tǒng)的蘇丹染料相比，油紅o可以顯示組織中更微小的脂滴并將脂滴染色為紅色，油紅o洗脫常用的溶劑為100%異丙醇。培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞或者是有脂肪沉積的組織按照說(shuō)明書的步驟染色后，用60%異丙醇稍洗去除非陽(yáng)性著色，用100%異丙醇洗掉陽(yáng)性油紅o染料，在490nm處測(cè)定吸光度值對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行取值分析。
其他具有類似性質(zhì)的染色方法也可以通過(guò)查閱資料找到合適的洗脫溶劑、洗脫時(shí)間和檢測(cè)波長(zhǎng)來(lái)進(jìn)行取值分析，具體流程可參考茜素紅和油紅o染色。
圖像處理法
（軟件分析）
圖像處理法要比吸光光度法對(duì)實(shí)驗(yàn)要求更低，適用的范圍更廣（包括細(xì)胞結(jié)果和切片結(jié)果，常規(guī)染色、特殊染色、免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光均可應(yīng)用），但是對(duì)成像的要求更高，要求取景定位和成像條件盡量一致。對(duì)于批量實(shí)驗(yàn)結(jié)果的處理更便捷。
圖像處理軟件量化陽(yáng)性區(qū)域面積或者光密度值的方法如下：
（1）在image j或ipp軟件中打開需要量化的圖片
（2）染色結(jié)果選擇image—type—rgb stack（操作完成之后下方滾動(dòng)條可以選擇特定顏色）
（3）閾值調(diào)整，手動(dòng)選擇出所需的色彩范圍
（4）讀取灰度值或?qū)⒒叶戎缔D(zhuǎn)換為光密度值
（5）選擇檢測(cè)內(nèi)容，一般應(yīng)選擇面積、灰度值（此時(shí)可轉(zhuǎn)換為光密度值）、陽(yáng)性面積百分比和檢測(cè)選中區(qū)域等選項(xiàng)（其中光密度值/面積即為平均光密度值）
（6）數(shù)值檢出（可以選擇整張圖片檢出，也可以選擇圖片上特定區(qū)域檢出，檢出的數(shù)值導(dǎo)出到excel之后即可用于分析作圖）
為了獲得可靠的結(jié)果，各組之間應(yīng)該控制相同的染色時(shí)間，拍照視野盡量選取相近的區(qū)域，分析結(jié)果時(shí)也應(yīng)該設(shè)置相同的閾值，可以使用image j的批處理功能快速計(jì)算結(jié)果。
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參考文獻(xiàn)
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