中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)
gb 5009.231-2016
食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)
水產(chǎn)品中揮發(fā)酚殘留量的測定
前 言
本標(biāo)準(zhǔn)代替sc/t 3031-2006《水產(chǎn)品中揮發(fā)酚殘留量的測定 分光光度法》。
本標(biāo)準(zhǔn)與sc/t 3031-2006相比，主要變化如下：
——將處理方法中的攪拌改為恒溫磁力攪拌；
——增加水蒸氣蒸餾儀為處理方法中的提取裝置。
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水產(chǎn)品中揮發(fā)酚殘留量的分光光度測定方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于水產(chǎn)品中可食部分揮發(fā)酚殘留量的測定。
2 原理
用堿性溶液破壞樣品組織結(jié)構(gòu)，在酸性條件下用水蒸氣蒸餾出揮發(fā)酚類化合物，在鐵氰化鉀存在下，與4-氨基安替比林反應(yīng)生成橙紅色的安替比林染料，用三氯甲烷萃取，在460nm 波長測定吸光度定量。
3 試劑和材料
除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為gb/t 6682規(guī)定的三級(jí)水。
3.1 試劑
3.1.1 三氯甲烷（chcl3）。
3.1.2 氨水（nh3·h2o）。
3.1.3 硫酸（h2so4）。
3.1.4 氫氧化鈉（naoh）。
3.1.5 鐵氰化鉀（k3[fe（cn）6]）。
3.1.6 硫酸銅（cuso4·5h2o）。
3.1.7 甲基橙（c14h15n3nao3s）。
3.1.8 氯化銨（nh4cl）。
3.1.9 4-氨基安替比林（c11h13n3o）。
3.1.10 活性炭粉末（粒徑0.1mm~0.5mm）。
3.2 試劑配制
3.2.1 無酚水：取實(shí)驗(yàn)用水，每升水中加入0.2g經(jīng)200℃烘干30min的活性炭粉末，充分振搖后，放置過夜，用雙層中速濾紙過濾后即可使用；或向?qū)嶒?yàn)用水中加氫氧化鈉（naoh）使水呈強(qiáng)堿性，并滴加高錳酸鉀溶液至紫紅色，移入全玻璃蒸餾器中加熱蒸餾，取餾出液備用。無酚水應(yīng)貯于玻璃瓶中，取用時(shí)應(yīng)避免與硅膠制品（橡皮塞或乳膠管等）接觸。
3.2.2 50%硫酸溶液：將濃硫酸在攪拌下緩緩加入等體積的實(shí)驗(yàn)用水中。
3.2.3 10%氫氧化鈉溶液：稱取10g氫氧化鈉溶于水中，稀釋至100ml，混勻。
3.2.4 8%鐵氰化鉀溶液：稱取8g鐵氰化鉀（k3[fe(cn)6]）溶于水中，稀釋至100ml，混勻，4℃冷藏，可使用一周。
3.2.5 10%硫酸銅溶液：稱取10g硫酸銅（cuso4·5h2o）溶于水中，稀釋至100ml，混勻。
3.2.6 0.05%甲基橙指示液：稱取甲基橙0.05g溶于水中，稀釋至100ml，混勻。
3.2.7 緩沖溶液：稱取20g氯化銨（nh4cl）溶于100ml氨水（nh3·h2o）中，ph 約10.7，4℃冷藏。
3.2.8 2% 4-氨基安替比林溶液：稱取2g 4-氨基安替比林（c11h13n3o）溶于水中，稀釋至100ml，4℃冷藏，可使用一周。
3.3 標(biāo)準(zhǔn)品
苯酚標(biāo)準(zhǔn)品（c6h6o），純度≥99%。
3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：稱取苯酚0.01g（精確至0.1mg）于50ml小燒杯中，加無酚水溶解，再轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，定容，混勻，于4℃保存，苯酚質(zhì)量濃度為100μg/ml，有效期為7d。
3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液：取適量苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，用無酚水稀釋至每毫升含1.00μg苯酚，配制后要在2h內(nèi)使用。
4 儀器和設(shè)備
4.1 水蒸氣蒸餾儀或500ml玻璃水蒸氣蒸餾裝置（見附錄a）。
4.2 天平：感量為0.1mg和0.01g。
4.3 500ml（梨形）分液漏斗。
4.4 磁力攪拌器。
4.5 分光光度計(jì)。
4.6 調(diào)溫電爐或調(diào)溫電加熱套。
4.7 組織搗碎機(jī)。
5 分析步驟
5.1 試樣制備及保存
水產(chǎn)品取可食部分用組織搗碎機(jī)勻漿后，攪拌均勻，分裝，密閉冷藏或冷凍保存。
5.2 試樣處理
5.2.1 蒸餾提取
稱取預(yù)處理的樣品10g~20g（精確到0.01g，同時(shí)做空白試驗(yàn)）放燒杯中，加入氫氧化鈉溶液75ml，用磁力攪拌器攪拌10min。再加3~5滴甲基橙溶液，用硫酸溶液調(diào)節(jié)ph≤4（溶液呈橙紅色），再加硫酸銅溶液5ml，混勻后，置于水蒸氣蒸餾儀提取瓶或500ml蒸餾瓶中，用少量無酚水洗凈燒杯，洗滌液并入水蒸氣蒸餾儀提取瓶或蒸餾瓶中并加數(shù)粒玻璃珠。
使用玻璃水蒸氣蒸餾裝置（或水蒸氣蒸餾儀）進(jìn)行蒸餾，應(yīng)連接好水蒸氣蒸餾裝置，確保嚴(yán)密不漏氣，取250ml錐形瓶接收餾出液，中速蒸餾60min~90min，至餾出液約240ml時(shí)，停止蒸餾，并用10ml無酚水沖洗冷凝管，洗滌液并入餾出液中（蒸餾過程中保持酸性）。蒸餾液應(yīng)盡量避免與橡膠制品接觸（橡皮塞、橡膠管和乳膠管里含有酚類化合物添加劑），如需使用時(shí)用硅膠管（塞）代替。
5.2.2 顯色
將餾出液移入分液漏斗中，加2.0ml緩沖溶液，混勻。加1.5ml4-氨基安替比林溶液，混勻，再加1.5ml鐵氰化鉀溶液，充分混勻后，放置10min。
5.2.3 萃取
準(zhǔn)確加入10.0ml三氯甲烷，密塞，劇烈振搖2min，靜置分層，徹底澄清透明后（不能存有氣泡），用干脫脂棉拭干分液漏斗頸管內(nèi)壁，于頸管內(nèi)塞入一小團(tuán)干脫脂棉，將三氯甲烷通過干脫脂棉團(tuán)，棄去最初濾出的數(shù)滴萃取液，直接放入光程為1cm 的比色皿中。安替比林染料用三氯甲烷萃取后，需6h以內(nèi)測定。
5.2.4 測定
于460nm 波長下，以空白三氯甲烷萃取液為參比，用分光光度計(jì)測量吸光度。
5.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
取8個(gè)分液漏斗，分別加入100 ml 水，依次加入0.0 ml、0.5 ml、1.0 ml、3.0 ml、5.0 ml、
7.0ml、10.0ml、15.0ml苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別加無酚水至250ml，顯色、萃取后，測定吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6 分析結(jié)果的表述
試樣中揮發(fā)酚的含量按式（1）計(jì)算：
式中：
x ——試樣中揮發(fā)酚的含量（以苯酚計(jì)），單位為毫克每千克（mg/kg）；
m1——由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得試樣溶液中苯酚的量，單位為微克（μg）；
m0——空白的苯酚量，單位為微克（μg）；
m ——試樣質(zhì)量，單位為克（g）。
計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。
7 精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。
8 檢出限
本方法檢出限：0.05mg/kg。