ws-100y人誘導型多能干細胞
細胞名稱：人誘導型多能干細胞
細胞貨號：ws-100y
細胞描述：將人包皮細胞誘導成 ips 細胞，通過重編程轉錄因子為：oct4、sox2、klf4、
myc 誘導建立 ips 細胞，培養(yǎng)時無需飼養(yǎng)層細胞。形 態(tài)：球形克隆
來源性別：男性疾 ?。航】?br>年 齡：新生兒
atcc number: acs-1011tm
凍存日期/代數(shù)：詳見 凍存管/培養(yǎng)瓶 標識建議復蘇培養(yǎng)體系：1 個 t25 培養(yǎng)瓶
細胞狀態(tài)：良好
支原體檢測結果：陰性
細胞用途：僅供科研使用。
ips細胞wan全培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細胞
1.試劑和材料
ips細胞wan全培養(yǎng)基試劑盒
成分
規(guī)格
數(shù)量
儲存條件
ips細胞基礎培養(yǎng)基
500ml
1瓶
2-8℃
ips細胞培養(yǎng)基添加劑
20ml
1支
-20℃
所需的其它試劑和材料
產(chǎn)品
規(guī)格
貨號
品牌
y27632
1mg
ipsmed-icell-ca005
matrigel
5ml
ipsmed-icell-ca004
ips細胞消化液
500ml
ipsmed-icell-ca003
es細胞專用凍存液
100ml
icell-0700-t
另需細胞培養(yǎng)皿/瓶/板，15ml離心管和移液管等細胞培養(yǎng)耗材
2.培養(yǎng)流程
2.1試劑的制備
2.1.1 wan全培養(yǎng)基制備
2.1.1在室溫（15-25℃）或冰箱內（2-8℃）過夜解凍細胞培養(yǎng)基添加劑，可在無菌條件下將添加劑分裝為適量的工作等份，并在-20℃下凍存。冷凍的分量須在3個月內用完。解凍后的分量應該一天內制備成wan全培養(yǎng)基。請勿在解凍后再次冷凍。
2.1.2.在無菌條件下將20ml的添加劑全部解凍后加入到500ml的基礎培養(yǎng)基中，充分混勻。wan全培養(yǎng)基在（2-8℃）下儲存時刻維持穩(wěn)定狀態(tài)最多2-3周，或在-20℃下冷凍時刻維持穩(wěn)定狀態(tài)最多3個月。在室溫（15-25℃）或冰箱內（2-8℃）過夜解凍冷凍的培養(yǎng)基，不要長時間放在37℃水浴內加熱培養(yǎng)基。
如果在無菌條件下制備，細胞wan全培養(yǎng)基可直接使用。
2.1.2 matrigel工作液的配制與包被
鑒于基質膠的操作環(huán)境要求比較嚴格，為保證您的實驗順利，特此對以下幾個方面進行溫馨提示：
1. 收貨時，首先確認還有干冰，matrigel成固態(tài)，液面水平，如有異常請及時拍照取證并聯(lián)系我們。
2. 整個matrigel只能分裝一次，在分裝前，要先放4℃冰箱（最好先把matrigel插在冰上，然后放入4℃冰箱）過夜，且分裝用的槍頭、ep管等都要提前-20℃預冷（基質膠在10℃以上會發(fā)成膠凝固導致基質膠報廢），整個分裝過程都需在冰上進行，且以后每次試驗時拿出本次用量所需的基質膠。
3. 實驗人員手心不要接觸基質膠，如：要手持裝有matrigel的ep管的上方，防止體溫使基質膠成膠凝固。
4. matrigel的稀釋比例建議為100倍稀釋。
本庫建議的配制matrigel工作液方法：
1. 稀釋前將matrigel放入4℃冰箱過夜融化。
2. 將適量體積的稀釋液（dmem/f12或pbs）置4℃冰箱預冷。
3. 將融化的matrigel與稀釋液從冰箱中取出并打開蓋子，用移液管吹吸稀釋液幾次以冷卻移液管，并吸取少量稀釋液加入matrigel管中混勻，將matrigel轉移到稀釋液中，并吹打混勻。（因為matrigel遇15℃以上溫度就會成凝膠粘在原裝玻璃壁和移液管壁上，故matrigel從冰箱拿出來以后盡快打開蓋子并轉移到預冷的稀釋液中，吸取matrigel的移液管一定要冷卻）。
4. 立即用稀釋后的matrigel包被培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿。對于6孔板，每個孔使用1ml稀釋后的matrigel，對于6cm的培養(yǎng)皿，每個孔使用2ml稀釋后的matrigel，晃動培養(yǎng)板使matrigel溶液均勻的分布在表面上。
5. 使用前，包被的培養(yǎng)板應放在培養(yǎng)箱（37℃）下至少1h。請勿讓培養(yǎng)板脫水。在培養(yǎng)板可供使用之前，請勿移除matrigel溶液。
如果不立即使用，培養(yǎng)板必須密封，以防止脫水。包被后的培養(yǎng)板可在2-8℃下最多儲存7天。
如果matrigel溶液并未wan全覆蓋表面，則無法實驗最佳的細胞培養(yǎng)，因此，不建議使用含有溶液已蒸發(fā)區(qū)域的培養(yǎng)板。
如果已將培養(yǎng)板在2-8℃下儲存，則在移除matrigel溶液之前，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱（37℃）下放置30min。
2.1.3 y27632的配制
y27632粉末溶解在pbs中，配制成濃度未10mm的儲存液，0.22μm濾膜過濾除菌。分裝后冷凍于-20℃。
y27632提高復蘇和傳代后的克隆形成率，所以只在復蘇和傳代步驟添加（1:1000，即終濃度為10μm），換液時不添加。
2.2.復蘇
在開始復蘇前，將所有試管、預熱后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿準備好，已確保盡快完成復蘇過程。
將凍存管從液氮中取出，快速在37℃水浴槽中解凍，輕柔持續(xù)地搖動凍存管，直到只剩下一個小冷凍團。從水浴槽取出凍存管，70%乙醇擦拭進行消毒。
使用移液管將凍存管中含有ips細胞的凍存液輕輕轉移至一個含有5-6ml已經(jīng)預熱的wan全培養(yǎng)基的15ml離心管中，過程必須輕柔防止吹散細胞團。
室溫300g離心5min。
吸出培養(yǎng)基，確保細胞團完整。
然后緩慢加入1mlwan全培養(yǎng)基，用手指輕彈離心管底部，使細胞團脫離底部并分散。
輕輕的將此1ml細胞懸液轉移至已包被的培養(yǎng)皿/板/瓶，根據(jù)最終培養(yǎng)細胞的液體體積，加入rock inhibitor y27632，終濃度為10μm。
將培養(yǎng)皿/板/瓶置于37℃培養(yǎng)箱中，每天更換培養(yǎng)基（換液不需要再添加y27632，但培養(yǎng)基需提前預熱）。
2.3.傳代
當集落變得較大、中心變得密集、明亮（對比邊緣），相鄰的集落開始融合時，此時可進行傳代。
傳代前，準備 37 ℃預熱好的無鈣鎂pbs 溶液及消化液，wan全培養(yǎng)基。
吸走上清，并加入37℃預熱好的pbs 溶液清洗1次。
加入適量（按 6 孔板每孔加 1ml，6cm 皿加 2ml，10cm 皿加 3ml 的量）的 37℃預熱好的消化液。
37℃放置1-2min，用手指輕彈皿/板/瓶身，顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離培養(yǎng)皿/板底，克隆內部大部分細胞成團脫落。
加入適量的wan全培養(yǎng)基終止消化。
移入離心管，300g離心5min。
離心后重懸（重懸步驟參照復蘇4-5步）。
傳代比例為 1：6—1：8，根據(jù)最終培養(yǎng)細胞的液體體積，加入rock inhibitor y27632，終濃度為10μm。
將培養(yǎng)皿/板/瓶置于37℃培養(yǎng)箱中，每天更換培養(yǎng)基（換液不需要再添加y27632，但培養(yǎng)基需提前預熱）。
2.4.凍存
當集落變得較大、中心變得密集、明亮（對比邊緣），相鄰的集落開始融合時，此時可進行傳代。
傳代前，準備37 ℃預熱好的無鈣鎂 pbs 溶液及消化液，wan全培養(yǎng)基。
吸走上清，并加入37℃預熱好的 pbs 溶液清洗1次。
加入適量（按 6 孔板每孔加 1ml，6cm 皿加 2ml，10cm 皿加 3ml 的量）的 37℃預熱好的消化液。
37℃放置1-2min，用手指輕彈皿/板/瓶身，顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離培養(yǎng)皿/板底，克隆內部大部分細胞成團脫落。
加入適量的wan全培養(yǎng)基終止消化。
移入離心管，300g離心5min。
離心后重懸（重懸步驟參照復蘇4-5步）。
使用預冷的凍存液輕輕的重懸細胞團，然后將細胞懸液轉移至凍存管，凍存按 6 孔板每孔凍 1 支，6cm 皿凍 2-4 支，10cm 皿凍 6-12 支。