漲知識 | qpcr專場七：認(rèn)識不同熒光定量pcr方法
熒光定量pcr是實(shí)驗(yàn)室中出鏡率非常高的一種檢測方法。該方法通過在pcr體系中添加熒光基團(tuán)來記錄dna產(chǎn)物的累積情況，從而達(dá)到對pcr過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控的目的，并且可以通過數(shù)據(jù)分析計(jì)算出起始模板量，這就是“熒光定量”中“定量”一詞的來源。熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)因?yàn)殪`敏度高所以經(jīng)常是差之毫厘謬以千里，所以在實(shí)驗(yàn)過程中，我們需要注意諸多細(xì)節(jié)，謹(jǐn)慎操作。小伙伴們看到這里就要著急了，我怎樣才能做好qpcr實(shí)驗(yàn)，拿到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)表高分文章，走上人生呢？
熒光定量pcr其本質(zhì)是通過熒光探針或熒光dna結(jié)合染料和實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀器對pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測和定量，儀器在pcr熱循環(huán)的過程中測量熒光。市面上有多種不同類型的熒光定量pcr試劑，這些熒光定量pcr試劑的差別是什么？如何根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)去選擇呢？小翌為大家細(xì)細(xì)道來~
圖.pcr循環(huán)流程
染料法與探針法的區(qū)別非特異性熒光標(biāo)記：染料法
sybr green 染料是一種熒光dna結(jié)合染料，能夠結(jié)合在任何雙鏈dna中的小溝上。該染料在游離狀態(tài)下，僅發(fā)出微弱的熒光，一旦和雙鏈dna結(jié)合，熒光信號便大大增強(qiáng)。在pcr循環(huán)中，每形成一條dna雙鏈，就有一定數(shù)量染料結(jié)合上去。隨著pcr反應(yīng)的進(jìn)行，越來越多的雙鏈dna形成，熒光強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。
由于sybr green 染料會和任意雙鏈dna結(jié)合并發(fā)出熒光信號。當(dāng)反應(yīng)中出現(xiàn)引物二聚體或者非特異擴(kuò)增時(shí)，便有可能產(chǎn)生明顯的假陽性信號。具體的表現(xiàn)是熔解曲線呈現(xiàn)雙峰或多峰，擴(kuò)增曲線中的ct值相比正常值偏小。
特異性熒光標(biāo)記：探針法目前市面上幾乎所有的探針法熒光定量pcr都是利用了熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，探針上存在一定對能產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的基團(tuán)，利用pcr反應(yīng)中的一些類似酶切、雜交等過程，使兩個(gè)基團(tuán)的距離發(fā)生變化，使得整個(gè)pcr系統(tǒng)中的熒光強(qiáng)度或者熒光種類發(fā)生變化，這種變化與pcr產(chǎn)物類型和產(chǎn)物量有直接關(guān)系。
探針法熒光定量有多種類型，例如taqman探針法、雙雜交探針法、分子信標(biāo)探針法和蝎形探針法等。其中taqman探針是最常見的探針方法，通常是設(shè)計(jì)一條與擴(kuò)增產(chǎn)物能互補(bǔ)能互補(bǔ)雜交的探針，在探針的5’端標(biāo)記報(bào)告基團(tuán)，在探針3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)之間距離很近，由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移存在，報(bào)告基團(tuán)在入射光激發(fā)下不會發(fā)出熒光信號。pcr反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，探針雜交在引物下游的位置，當(dāng)dna擴(kuò)增酶移動到探針位置上時(shí)，酶本身5’-3’端的外切酶活性會從5’端切割探針，從而使5’端報(bào)告基團(tuán)和3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)分離，當(dāng)基團(tuán)之間的距離超過熒光共振能量轉(zhuǎn)移的范圍，報(bào)告基團(tuán)在光照射下，就可發(fā)出一定的熒光。由于探針是針對目標(biāo)序列設(shè)計(jì)，是特異性的，故而熒光的種類和光信號強(qiáng)度能特異性指示目標(biāo)序列的種類和數(shù)量。
染料法vs.探針法
染料法熒光定量pcr
探針法熒光定量pcr
特異性
中
高
靈敏度
中
高
可重復(fù)性
中
高
多重反應(yīng)
-
可多重
探針/引物設(shè)計(jì)
引物
探針+引物
實(shí)驗(yàn)成本
低
高
應(yīng)用
特定基因表達(dá)差異分析；dna定量
特定基因表達(dá)分析；dna定量；snps基因分析；基因突變檢測；產(chǎn)前遺傳病檢測；傳染病早期病原體檢測
不同應(yīng)用的染料法熒光定量進(jìn)行熒光定量時(shí)，靶標(biāo)均為dna模板，但是不同來源的dna，會存在一定的差異。通常進(jìn)行染料法熒光定量時(shí)，選用的最適dna產(chǎn)物長度為80-300bp。但是當(dāng)dna由18-28個(gè)核苷酸組成的mirna反轉(zhuǎn)錄得到時(shí)，選用正確的熒光定量試劑變得尤為重要。
mirna的染料法熒光定量檢測mirna的長度很短，通常約18-28個(gè)核苷酸，因此無法采用常見的普通反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量pcr試劑進(jìn)行mirna的檢測。目前，市面上采用兩種方法對mirna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，一種是加尾法(加a法)，另一種是莖環(huán)法。兩種方式均是通過人為加長序列的方式獲取第一鏈cdna，該cdna的長度通常在60-80nt左右。另外不同mirna之間堿基序列的差異不大，在僅有的18-28個(gè)核苷酸內(nèi)，不同mirna甚至?xí)霈F(xiàn)僅1個(gè)核苷酸不同的現(xiàn)象，高效特異性區(qū)分不同mirna也十分重要。因此，常規(guī)的熒光定量可能難以滿足mirna實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)所需，需要選用專門針對短片段擴(kuò)增，且能高特異性準(zhǔn)確定量的熒光定量試劑。
mirna的定量檢測不僅可以選用染料法熒光定量，也可選用適宜的探針法熒光定量。
常見dna的染料法熒光定量檢測市面上常見的染料法熒光定量試劑均可滿足常見dna的熒光定量檢測，但需要注意的是，由于染料法熒光定量中染料結(jié)合任意雙鏈dna的特性，除需要精心設(shè)計(jì)引物和進(jìn)行熔解曲線分析以外，最好選用保證靈敏度和特異性雙兼顧的染料法熒光定量試劑，減少因?yàn)閐na擴(kuò)增酶本身特異性原因造成的非特異擴(kuò)增。
不同應(yīng)用的探針法熒光定量探針法熒光定量按照檢測靶標(biāo)數(shù)量可分為單重?zé)晒舛縫cr和多重?zé)晒舛縫cr。單重?zé)晒舛縫cr相對來說比較簡單，即在單個(gè)孔中通過一次pcr反應(yīng)針對一個(gè)基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測。而多重?zé)晒舛縫cr則是在單孔中通過一次pcr反應(yīng)同時(shí)針對多個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，利用一定的檢測方式實(shí)現(xiàn)對多個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行檢測。那么，在實(shí)際使用時(shí)，有什么具體的差別呢？
場景模擬采用相對定量法分析并確定某個(gè)生物體經(jīng)過藥物處理后目的基因的表達(dá)情況。采用單重?zé)晒舛縫cr試劑，則每個(gè)孔中只有一個(gè)基因(內(nèi)參基因或目的基因)擴(kuò)增，若技術(shù)重復(fù)為三次，則需要將樣品分成6份，3個(gè)用于內(nèi)參基因檢測，3個(gè)用于目的基因檢測，用以檢測目的基因的表達(dá)情況。而采用多重?zé)晒舛縫cr，進(jìn)行三次技術(shù)重復(fù)，僅需將樣品分成3份，3個(gè)孔中通過用一個(gè)pcr反應(yīng)擴(kuò)增內(nèi)參基因和目的基因，從而檢測目的基因的表達(dá)情況。多重?zé)晒鈾z測，可以通過單個(gè)pcr反應(yīng)中進(jìn)行多個(gè)基因的擴(kuò)增從而減少qpcr反應(yīng)所需要的樣品量，且該方式和單重?zé)晒舛繖z測一樣靈敏準(zhǔn)確。除了節(jié)省樣本量外，還可節(jié)省試劑以及設(shè)置實(shí)驗(yàn)程序和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果所需要的時(shí)間。單孔擴(kuò)增多個(gè)基因也可最大限度地減少移液誤差。使用多重?zé)晒舛縫cr也有需要注意的事項(xiàng)，其中最為重要的是，需要保證不同基因在單重?zé)晒舛糠磻?yīng)中和多重?zé)晒舛糠磻?yīng)中的結(jié)果是一致的。尤其是擴(kuò)增的基因中同時(shí)存在著低豐度表達(dá)基因和高豐度表達(dá)基因。
兩步rt-qpcr與一步rt-qpcr的區(qū)別兩步rt-qpcr首先在一管中使用反轉(zhuǎn)錄酶將rna反轉(zhuǎn)錄成cdna，通常選用隨機(jī)引物、oligo dt或基因特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。完成反轉(zhuǎn)錄后，吸取約10%左右的cdna用于后續(xù)熒光定量pcr。
兩步法rt-qpcr的優(yōu)點(diǎn)cdna量充足：反轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的cdna可選擇通過稀釋或者直接使用的方式滿足多次實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)驗(yàn)；
滿足多靶標(biāo)：通過oligo dt和隨機(jī)引物，可以從單個(gè)rna樣本中擴(kuò)增多個(gè)靶標(biāo)。
兩步法rt-qpcr的缺點(diǎn)便捷性差：兩步反應(yīng)需要更多的處理，不太適合高通量應(yīng)用；
污染風(fēng)險(xiǎn)：由于每個(gè)步驟都需要使用單獨(dú)的管子，污染的風(fēng)險(xiǎn)增加；
cdna產(chǎn)物中殘留試劑的抑制：反轉(zhuǎn)錄酶和反轉(zhuǎn)錄緩沖液殘留會一定程度抑制熒光定量pcr，因此在熒光定量pcr中建議僅使用10%的cdna進(jìn)行反應(yīng)。若稀釋不當(dāng)，相關(guān)殘留組分可能會抑制dna聚合酶。
當(dāng)起始模板是rna時(shí)，可選用一步rt-qpcr進(jìn)行定量檢測。和常規(guī)的兩步rt-qpcr不同的是，該方法在同一管封閉狀態(tài)下，完成了反轉(zhuǎn)錄和熒光定量pcr，節(jié)省了操作步驟和操作時(shí)間，并減少了反復(fù)開蓋帶來的風(fēng)險(xiǎn)?；蛱禺愋砸锸潜仨毜?，用于反轉(zhuǎn)錄和定量擴(kuò)增。若采用oligo dt或隨機(jī)引物將會在一步法中產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物并減少目標(biāo)產(chǎn)物的量。
一步法rt-qpcr的優(yōu)點(diǎn)減少污染：一管一步式可防止在反轉(zhuǎn)錄和熒光定量pcr階段之間引入污染物；
便捷：移液步驟減少，手動操作時(shí)間減少；
高通量檢測：每個(gè)樣本獲得結(jié)果的總時(shí)間縮短且可重現(xiàn)性高；
靈敏度高：所有產(chǎn)生的第一鏈cdna都可用于實(shí)時(shí)pcr擴(kuò)增，一定程度上提高靈敏度。
一步法rt-qpcr的缺點(diǎn)二聚體風(fēng)險(xiǎn)增加：上下游基因特異性引物在42℃-50℃下更易發(fā)生二聚體聚合，從而導(dǎo)致非特異擴(kuò)增；
檢測靶標(biāo)數(shù)少：單一rna模板能夠檢測的靶標(biāo)數(shù)量相對較少。
以上是對不同熒光定量pcr方法的介紹，相信小伙伴們通過小翌的介紹，對如何選擇適合自己的熒光定量pcr方法已經(jīng)有一定的了解啦。關(guān)于如何做好qpcr實(shí)驗(yàn)，小翌會陸續(xù)在公眾號里傳授秘籍噠，敬請期待哦。
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