對于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來說，祛除dna、rna、核酸酶污染十分重要，是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定的關(guān)鍵因素之一。
rna干擾(rna interference, rnai)是一種由小rna介導(dǎo)的保守的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制。它在真核生物的基因調(diào)控、腫瘤進(jìn)展、抗病毒防御和控制基因組轉(zhuǎn)座因子等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。
在這一途徑中，argonaute (ago)蛋白，作為rna誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(risc)的組成部分，利用其結(jié)合的小非編碼rna通過互補(bǔ)堿基配對識別靶rna。這些小rna可以是由短發(fā)夾rna (pre-mirna)產(chǎn)生的micrornas (mirnas)，也可以是由雙鏈rna (dsrna)產(chǎn)生的小干擾rna (sirna)，它們都是21-25核苷酸(nt)雙鏈，在5 '端有磷酸，在3 '端有一個(gè)2-nt懸垂末端，羥基末端在5 '端。
在哺乳動(dòng)物中，mirna和sirna由相同的rnase-iii酶dicer產(chǎn)生，而在果蠅中，它們通常不僅由不同的dicer (dmdcr-1和dmdcr-2)產(chǎn)生，而且分別被分類為功能不同的argonaute蛋白，如dmago1和dmago2。
dicer是rnase-iii酶家族的一員，在真核生物中高度保守。它由多個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，包括n端dexd/h解旋酶(helicase)結(jié)構(gòu)域、cap結(jié)構(gòu)域(platform結(jié)構(gòu)域和paz結(jié)構(gòu)域)、具有兩個(gè)rnase-iii結(jié)構(gòu)域的核心區(qū)和c端雙鏈rna結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dsrbd)。這些結(jié)構(gòu)域的排列和協(xié)作對于確定rnase iii切割的rna分子的精確長度和結(jié)構(gòu)特征至關(guān)重要。hsdicer (human dicer)和dmdcr-1中的解旋酶結(jié)構(gòu)域?qū)srna結(jié)合的親和力較低，缺乏水解atp的能力。因此，它們的主要底物僅限于短發(fā)夾狀的pre-mirna。相比之下，dmdcr-2的解旋酶結(jié)構(gòu)域不同于hsdicer或dmdcr-1，因?yàn)樗梢愿哂H和力地與dsrna結(jié)合，并促進(jìn)atp水解，將dsrna底物轉(zhuǎn)運(yùn)到rna加工中心。
當(dāng)小rna雙工前體被dicer蛋白加工時(shí)，由多個(gè)dsrbds組成的輔因子dsrna結(jié)合蛋白(dsrbps)協(xié)助dicer完成切割過程，并將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到argonaute蛋白。在這些輔助因子中，哺乳動(dòng)物的trbp/pact和果蠅的r2d2/ loqs已經(jīng)得到了很好的研究。這些輔因子以化學(xué)計(jì)量比與dicer結(jié)合，并影響其裂解活性、產(chǎn)物長度和產(chǎn)物傳遞等。所有的dsrbd都有一個(gè)共同的α -β -β -β - α-折疊，但根據(jù)它們與dsrna的結(jié)合能力，它們可以分為兩類。a型dsrbd具有類似的與序列無關(guān)的dsrna結(jié)合方式，而b型dsrbd沒有dsrna結(jié)合活性20,21。trbp/pact和loqs-pa/loqs-pb分別有2個(gè)a型dsrbd和1個(gè)b型dsrbd結(jié)合hsdicer和dmdcr-1，分別為。r2d2和loqs異構(gòu)體d (loqs- pd)有兩個(gè)a型dsrbd，作為dmdcr -2的伴侶蛋白。
一般認(rèn)為，dmdcr-2產(chǎn)生兩種sirna，一種是防御病毒的外sirna，另一種是保護(hù)基因組完整性免受轉(zhuǎn)座元件嚴(yán)重威脅的內(nèi)sirna(或esirnas)。在dsrna底物的切割過程中，dmdcr-2被觀察到多種構(gòu)象狀態(tài)，包括易位狀態(tài)、主動(dòng)切割狀態(tài)和切割后狀態(tài)等。loq - pd的存在通過增加解旋酶域的初始dsrna結(jié)合率來增強(qiáng)dmdcr-2的加工活性。在dsrna底物切割后，r2d2幫助dmdcr-2利用hsp70/90伴體系統(tǒng)將產(chǎn)物sirna雙工引導(dǎo)到rna干擾效應(yīng)物ago2中，而不是增強(qiáng)其切割活性。因此，r2d2是risc加載復(fù)合體(rlc)的重要組成部分。據(jù)報(bào)道，loq - pd和r2d2在sirna途徑中依次作用，并且它們是由外源性或內(nèi)源性dsrnas35觸發(fā)的常見沉默。