好的引物會(huì)讓pcr實(shí)驗(yàn)成功一半，因而，引物設(shè)計(jì)一直都是pcr非常重要的環(huán)節(jié)。經(jīng)典之法就是讓premier5攜手oligo，共同設(shè)計(jì)pcr引物。1、以小鼠的il-17為例，進(jìn)入ncbi界面,選擇nucleotide后，輸入il-17，點(diǎn)擊search。然后選擇人類(lèi)il-17的mrna，在cds選項(xiàng)中，找到編碼區(qū)所在位置，在下面的origin中，選定目的序列。2、打開(kāi)primerpremier5軟件，點(diǎn)擊菜單欄file|new|dnasequence，在出現(xiàn)的對(duì)話框里黏貼目的序列，并在paste對(duì)話框里選擇asis，點(diǎn)擊ok。3、點(diǎn)擊primer，彈出菜單后點(diǎn)擊search按鈕。在彈出的searchcriteria中，選擇pcrprimers，pairs參數(shù)，并選擇所需pcr產(chǎn)物長(zhǎng)度，點(diǎn)擊ok。在彈出的search progress菜單中，點(diǎn)擊ok。4、在搜索出的結(jié)果列表里選擇rating值高，bug較少的引物#1，在primerpremier中選擇s（正義鏈）/a（反義鏈），點(diǎn)擊editprimer，將所得引物改成為rating值為100，無(wú)bug的引物，即無(wú)發(fā)夾（hairpin）、無(wú)二聚體（dimer）、無(wú)錯(cuò)配（falsepriming）和交叉配對(duì)（crossdimer）的引物。點(diǎn)擊acceptandquit命令即可。5、點(diǎn)擊菜單欄中edit∣copy∣senseprimer/anti-senseprimer，即可得到設(shè)計(jì)的引物。6、接下來(lái)，就要用oligo軟件驗(yàn)證評(píng)估premier5軟件所設(shè)計(jì)的引物，單擊菜單欄里file∣newsequence可打開(kāi)以下窗口，并將設(shè)計(jì)好的上游引物黏貼在空白框里。7、點(diǎn)擊菜單欄里accept/discard中的accept，則會(huì)出現(xiàn)tm、△g和frq三個(gè)窗口,△g值反應(yīng)了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度，最好引物的△g值在5’端和中間值比較高，而在3’端相對(duì)較低。8、點(diǎn)擊菜單欄里的select中的upperprimer將當(dāng)前引物設(shè)置為上游引物。同時(shí)點(diǎn)擊菜單欄里的edit中的“l(fā)owerprimer”命令，在editlower窗口中輸入下游引物的序列。點(diǎn)擊acceptandquit命令即可。9、最后，在菜單欄中analyze完成引物△g值、tm值、引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的分析后，可將引物序列送至公司進(jìn)行合成即可。
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