1 材料和方法
1. 1 樣本的采集
結合南京機場、新生圩港及王家灣出入境檢驗檢疫日常檢疫工作,從2001年～2007年廣泛采集來自日本、美國、中國香港、中國臺灣等國家和地區(qū)的松木、松木制品及木質包裝和襯墊木等,記錄樣本采集的時間、采集方式和采集部位。對取回的樣本有無變色菌存在、有無天牛蟲道和有無松脂香味及木材含水量等癥狀觀察并作記錄。
1. 2 線蟲的培養(yǎng)
1. 2. 1 真菌培養(yǎng)
選擇了灰葡萄孢(b otry tis cinerea ) 、盤多毛孢( pestalotia) 、絲核菌(rhizoctania) 、菌核病菌(s clero2tin ia sclerotirum ) 、平臍蠕孢(b ipola ris sative) 、鐮刀菌( fusarium ) 、仁果叢梗孢(m onilia fructgena) 、叢梗孢(m onilia laxa)和彎孢菌(curvu laria)等9種真菌培養(yǎng)松材線蟲。將9種真菌的菌絲塊移植于pda平板(直徑8. 5cm)上。每菌種移植8皿,待菌絲長滿平板后,在每皿中挑入經(jīng)表面消毒過的松材線蟲200條。線蟲的表面消毒劑是10 g/ml的放線菌酮及0. 08%的硫酸鏈霉素 。所有上述步驟均在無菌下操作。線蟲移入平板后,放置于24℃恒溫箱中15～20 d分別各檢查半數(shù)皿中的線蟲量,然后再計算松材線蟲的平均值。
1. 2. 2 樣本保濕培養(yǎng)
結合口岸松材線蟲檢疫時進行,僅存在幼蟲的樣本一般在12月左右采集,用紗布包裹長和寬都為5cm左右的樣本,放置于直徑10cm的燒杯中,置于25～28℃培養(yǎng)箱內,定期澆水使紗布經(jīng)常保持濕潤。每天收集燒杯底部積水并觀察有無松材線蟲成蟲。
2 結果
2. 1 口岸松材線蟲檢疫的截獲規(guī)律
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? 木材含水量= (烘干前鮮重- 烘干后恒定重量) /烘干前鮮重
2001～2007年在南京機場、新生圩和王家灣口岸對進境的木包裝、支撐木、填充木、固定木、墊倉木及壓角木上線蟲調查情況見表1。表1表明,來自松材線蟲疫區(qū)的木質結構材料,可以傳帶松材線蟲;分離到松材線蟲、傘滑刃屬其它線蟲和滑刃屬線蟲的木樣中都伴生變色菌(一種或幾種真菌) ; 4次截獲松材線蟲的樣本均來自日本,其含水量在17% ～23%,所有截獲到線蟲的樣本含水量在14%～24%;松材線蟲截獲時間發(fā)生在1 月( 1 次)、3 月(1 次)和12 月( 2次) ;分離到線蟲的樣本都在1～5月和9～12月采集,其它月份調查的樣本中未發(fā)現(xiàn)活線蟲。
2. 2 9種真菌培養(yǎng)松材線蟲的效果
在同樣條件下,用不同的真菌培養(yǎng)松材線蟲20d和15d的各處理中,線蟲的繁殖量很不一致(表2) 。培養(yǎng)松材線蟲效果最好的是灰葡萄孢,在培養(yǎng)15d的處理中平均出現(xiàn)26350條松材線蟲;其次是盤多毛孢、鐮刀菌和仁果叢梗孢彎孢菌培養(yǎng)松材線蟲效果最差。此外,培養(yǎng)20d時的pwn蟲量普遍地較培養(yǎng)15d時蟲量下降。另外,采用的松材線蟲罹病木中存放2～3 個月后再分離的幼蟲(為體中有脂肪滴的分散型幼蟲)用灰葡萄孢霉培養(yǎng)中,接種的200條幼蟲繁殖3天后,就發(fā)現(xiàn)了14條雌蟲和9條雄蟲。
2. 3 樣本保濕培養(yǎng)松材線蟲的效果
樣本保濕法培養(yǎng)松材線蟲結果表明,僅有松材線蟲幼蟲存在且每g木材中松材線蟲含量在1條以上的病木,經(jīng)25～28℃溫度下3～4 d就可收集到足夠用于準確鑒定所需的松材線蟲雌、雄成蟲( 15條以上) 。
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3 討論和結論
7年來對來自機場、新生圩和王家灣木材樣本的松材線蟲調查中,注意到對來自疫區(qū)的寄主苗木傳播松材線蟲的可能性極小,因為在輸出和輸入口岸檢疫中,人們往往比較重視繁殖材料的檢疫問題,尤其是對松材線蟲這種公認為毀滅性的病害。貿易性進口的原木、板材等,其產(chǎn)地樹種都比較明確,經(jīng)口岸正常渠道入境和檢疫,較容易把住松材線蟲檢疫關。而口岸上更多(批次)的是以木包裝、襯墊木、填充木、壓角木等形式出現(xiàn),在調查研究過程中都是發(fā)生在木包裝上,一定程度上說明了這些進境的木質材料具有更大的傳播危險性,也是我國松材線蟲疫區(qū)或部分疫區(qū)病源傳播的最可能途徑。
調查中發(fā)現(xiàn),在6年取樣、分離線蟲中,所有線蟲的發(fā)現(xiàn)都發(fā)生在1～5月和9～12月,分析其原因可能和長江中下游地區(qū)夏季高溫(6～8月份,南京集裝箱中高溫在45～55℃可持續(xù)1h以上) ,木質材料中線蟲被自然高溫殺死有關;松材線蟲在1月、3月和12月被發(fā)現(xiàn),應該和日本木材采伐時間及松材線蟲為害后,寄主一般在當年9月之后發(fā)病的規(guī)律有聯(lián)系。為此,在南京周邊地區(qū)應重點加強1～5月和9～12月對松材線蟲的檢疫工作。
由于口岸檢疫中發(fā)現(xiàn)松材線蟲時,經(jīng)常出現(xiàn)僅有幼蟲(4次發(fā)現(xiàn)中2次僅存在幼蟲)的現(xiàn)象,因此我們對松材線蟲培養(yǎng)方法進行了研究。結果證明,繁殖松材線蟲的真菌灰葡萄孢霉、盤多毛孢、鐮刀菌和仁果叢孢都有很好和相似的培養(yǎng)效果,其它供試的幾種真菌也可用作培養(yǎng),這就為口岸檢疫人員和森林檢疫工作者提供了更多可供選擇的松材線蟲真菌培養(yǎng)源;用灰葡萄孢( 25～28℃)培養(yǎng)的幼蟲, 3 d就有了進行初步鑒定的充足雌、雄成蟲,這說明現(xiàn)階段口岸檢疫中依靠常規(guī)形態(tài)鑒定來檢疫松材線蟲的方法仍比較高效和準確。在不具備松材線蟲培養(yǎng)條件的口岸單位或其它植物檢疫部門,本文試驗的“紗布保濕培養(yǎng)法”也較為有效且方便易行。